Chúng tôi kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD 2C1 và 1C10 bằng phương pháp Western blot trên kháng nguyên tái tổ hợp và trên dịch chiết tế bào biểu hiện kháng nguyên tự nhiên.
Kháng thể 2C1 kháng protein E7 HPV16
Chúng tôi kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD 2C1 với protein E7 HPV16 tái tổ hợp bằng phương pháp Western blot. KTĐD kháng protein E7 HPV16 thương mại (Santa Cruz) được chọn làm chứng dương cho thí nghiệm.
Hình 35. Kết quả SDS-PAGE và Western blot trên KTĐD kháng E7 HPV 6, E7 HPV 11, E7 HPV 16, E7 HPV 18 với các protein tái tổ hợp tương ứng. (A) Điện di SDS-PAGE các protein
tái tổ hợp. Giếng M: thang protein ;giếng 1, 2, 3, 4: protein tái tổ hợp E7 HPV 16, E7 HPV 16, E7 HPV 11, E7 HPV 18. (B) KTĐD 2C1;giếng 1, 2, 3, 4: protein tái tổ hợp E7 HPV 16, E7 HPV
6, E7 HPV 11, E7 HPV 18.(C) KTĐD kháng E7 HPV 16 thương mại (Santa Cruz);giếng 1, 2, 3, 4: protein tái tổ hợp E7 HPV 18, E7 HPV 11, E7 HPV 6, E7 HPV 16.
Kết quả điện di SDS-PAGE (hình 35A, giếng 1) cho thấy sự xuất hiện một vạch có kích thước khoảng 20 kDa phù hợp với kích thước mong đợi của protein E7 HPV 16 tái tổ hợp. Kết quả Western blot sử dụng KTĐD 2C1 và KTĐD thương mại đều cho thấy sự xuất hiện một vạch tín hiệu dương tính tương ứng với kích thước mong đợi cho protein
~ 25 kDa
60
tái tổ hợp (hình 35B, giếng 1 và C, giếng 4). Không thấy xuất hiện tín hiệu ở các giếng chứa các protein khác như E7 HPV 6/11/18. Kết quả trên cho thấy : (1) KTĐD 2C1 tương tác đặc hiệu với protein E7 HPV 16 giống như KTĐD thương mại và không cho phản ứng chéo với protein E7 của các type 6, 11, 18 ; (2) KTĐD 2C1 tương tác với epitope dạng thẳng của protein E7 HPV 16 tái tổ hợp.
Tiếp theo, chúng tôitiếp tục sử dụng phương pháp Western blot để phát hiện protein E7 trong dịch ly giải tế bào CaSki. Chúng tôi chọn tế bào CaSki cho các thí nghiệm này vì đây là dòng tế bào UTCTC được ghi nhận có chứa khoảng 600 bản sao DNA của virus HPV 16 trong bộ gene và biểu hiện tự nhiên protein E7 HPV 16 với kích thước vào khoảng 20 kDa. Bên cạnh đó, dòng tế bào UTCTC C-33 A không mang DNA của HPV 16 được chọn làm chứng âm để kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD.
Hình 36. Kết quả Western blot giữa KTĐD 2C1 với dịch ly giải tế bào CaSki, C-33 A và protein E7 HPV-16 tái tổ hợp. Giếng M: thang phân tử lượng protein; giếng 1: 50 µg dịch ly giải tế bào CaSki ; giếng 2: 5 µg protein E7 HPV 16 tái tổ hợp; giếng 3:50 µg dịch ly giải tế bào
C-33 A.
Ở các giếng chứa protein tổng số của tế bào CaSki và protein E7 HPV 16 tái tổ hợp (hình 36, giếng 1 và 2) đều xuất hiện tín hiệu lai ở vị trí có kích thước khoảng 20 kDa tương ứng với kích thước dự đoán của protein E7. Tín hiệu lai không xuất hiện ở giếng chứa protein tổng số từ tế bào C-33 A (hình 36, giếng 3). Như vậy, KTĐD 2C1 tương tác đặc hiệu với cả protein tái tổ hợp lẫn protein biểu hiện tự nhiên trong tế bào CaSki.
Kháng thể 1C10 kháng protein p16INK4A
Tương tự, chúng tôi kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD 1C10 với protein p16INK4A
tái tổ hợp và protein p16INK4A từ dịch ly giải tế bào HeLa bằng phương pháp Western blot.
KTĐD kháng protein p16INK4A thương mại (Santa Cruz) là chứng dương cho thí nghiệm.
Kết quả SDS-PAGE cho thấy sự xuất hiện một vạch kích thước khoảng 18,4 kDa
61
blot cho thấy tín hiệu dương tính với cả KTĐD 1C10 (hình 37, giếng 2) và KTĐD thương
mại (hình 37, giếng 3) ở vạch dự đoán cho p16INK4A tái tổ hợp. Như vậy, KTĐD 1C10 có
khả năng tương tác với các epitope dạng thẳng của protein p16INK4A tái tổ hợp.
Hình 37. Kết quả SDS-PAGE và Western blot trên KTĐD 1C10 với protein p16INK4A tái tổ
hợp. Giếng (M) thang protein; giếng (1) điện di SDS-PAGE protein p16INK4A tái tổ hợp;
giếng (2) lai KTĐD 1C10 với protein p16INK4A tái tổ hợp đã được biến tính; giếng (3) lai
KTĐD thương mại với protein p16INK4A tái tổ hợp đã được biến tính
Hình 38. Kết quả Western blot của các KTĐD 1C10 và thương mại với dịch ly giải tế bào
HeLa, MCF7 và protein p16INK4Atái tổ hợp. Giếng M: thang phân tử lượng protein; giếng 1: 5
μg protein p16INK4A tái tổ hợp, giếng 2: 50μgdịch ly giải tế bào HeLa, giếng 3:50 μg dịch ly giải
tế bào MCF7.
Kết quả Western blot sử dụng KTĐD 1C10 (hình 38 A) và KTĐD thương mại
(hình 38 B) với protein p16INK4A tái tổ hợp (hình 38 A/B, giếng 1) và protein tổng số của
tế bào HeLa (hình 38 A/B, giếng 2) đều cho thấy tín hiệu lai ở vị trí tương ứng với kích
thước dự đoán của p16INK4A. Trong khi đó, tín hiệu lai không xuất hiện ở giếng có protein
tổng số từ tế bào MCF-7 (hình 38 A/B, giếng 3). Như vậy, KTĐD 1C10 có phản ứng đặc
hiệu với protein p16INK4A tự nhiên tồn tại trong dòng tế bào UTCTC HeLa.
62
Sử dụng phần mềm ImageJ để phân tích kết quả điện di SDS-PAGE (phụ lục 10) phân đoạn KTĐD sau tinh sạch, chúng tôi xác định được độ tinh sạch của KTĐD 2C1
(kháng E7 HPV 16), 1C10 (kháng p16INK4A), 4H5 (kháng E7 HPV 18) và 1D5 (kháng E7
HPV 18) lần lượt là 95,17 %, 92,01 %, 90,32 % và 98,73 %.