Phương pháp tạo dòng biểu hiện

Phương pháp tạo dòng biểu hiện dùng để tạo các vector tái tổ hợp mang các gene

E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 18 và p16INK4A. Có 4 hệ vector được sử dụng là plasmid

pET28a(+), pE-SUMO3, pETM44 và pGAT nhưng cách tiến hành không có khác biệt, và

bao gồm ba bước : (1) tạo vector tái tổ hợp, (2) biến nạp vector tái tổ hợp vào E.

coliDH5α và E.coli BL21 (DE3), (3) chọn lọc dòng có mang gene mong muốn. 3.2.6.1. Tạo vector tái tổ hợp mang gene mong muốn

 Thủy giải plasmid và sản phẩm PCR bằng các enzyme phù hợp (bảng1) theo

hai bước : bước 1, sản phẩm PCR và plasmid được cắt bằng enzyme cắt giới hạn I ; bước 2, plasmid và sản phẩm cắt giới hạn ở bước 1 được tiếp tục cắt bằng enzyme II.

Mỗi phản ứng thủy giải được tiến hành trong thể tích 40 µl : 2 µl plasmid /sản phẩm PCR (hoặc sản phẩm cắt giới hạn) với lượng khoảng 0,4-2 µg/phản ứng, 4 µl buffer

10 X, 4 µl BSA 10 X, 1 µl enzyme cắt giới hạn phù hợp (10 unit/ul) (bảng 1), 29 µl H2O

đã loại bỏ nuclease (nuclease free), ủ ở nhiệt độ phù hợp trong 4 giờ. Sau đó, thu nhận sản

phẩm cắt giới hạn bằng 2 thể tích ethanol tuyệt đối lạnh để tủa ở -20oC trong 2 giờ. Tủa

này sẽ được hòa trong 31 µl nước đã loại bỏ nuclease và bổ sung các thành phần buffer 10 X, BSA 10 X và emzyme cắt thứ 2, ủ ở nhiệt độ phù hợp trong 4 giờ.

Sản phẩm cắt giới hạn cuối cùng được tinh sạch bằng phương pháp phenol:chloroform:isoamyl alcohol (mục 2.4).

Bảng 1. Các plasmid sử dụng và enzyme cắt giới hạn tương ứng.

Plasmid Enzyme cắt giới hạn I Enzyme cắt giới hạn II

pET28(a) NdeI SalI

pE-SUMO3 BsaI SalI

pETM44 NcoI SalI

pEGFP-C2 HindIII SmaI

pGAT NcoI SmaI

 Thiết lập phản ứng nối trong thể tích 10 µl : 1 µl buffer T4 DNA ligase 10X,

1µl plasmid đã xử lý enzyme cắt giới hạn với lượng khoảng 100-200 ng/phản ứng, một thể tích sản phẩm PCR đã xử lý enzyme sao cho đáp ứng tỉ lệ khối lượng giữa sản phẩm

19

PCR và plasmid bẳng 3:1 hay 1:1, 1 µl T4 DNA ligase (1 unit/µl), thêm H2O đã loại bỏ

nuclease đủ 10 µl. Phản ứng nối được thực hiện ở 16°C qua đêm.

3.2.6.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli DH5α vàBL21 (DE3)

Chuyển tế bào E. coli DH5α từ ống nghiệm giữ giống vào ống nghiệm chứa 5 ml

môi trường LB. Nuôi cấy lắc qua đêm ở 37°C. Cấy 500 µl dịch nuôi cấy trên vào 50 ml

môi trường LB, nuôi cấy lắc ở 37°C, 2 giờ đến khi đạt giá trị OD600 trong khoảng 0,3 –

0,6. Ly tâm thu sinh khối tế bào (5000 vòng/phút - 5 phút - 4°C). Hòa sinh khối trong 25

ml dung dịch CaCl2 100 mM lạnh. Ủ trên nước đá 30 phút. Ly tâm thu sinh khối tế bào

(5000 vòng/phút - 5 phút - 4°C). Huyền phù nhẹ nhàng sinh khối tế bào khả nạp trong 1

ml dung dịch CaCl2 100 mM. Cho toàn bộ phản ứng nối vào 100 µl tế bào khả nạp. Ủ trên

nước đá 30 phút. Gây sốc nhiệt ở 42°C - 90 giây. Chuyển vào khay đá, ủ trong 2 phút. Bổ sung 900 µl môi trường LB và nuôi ủ trong 1 giờ. Ly tâm thu sinh khối (10.000 vòng/phút - 1 phút). Hòa sinh khối trong 50 µl LB và trải dịch huyền phù vi khuẩn trên đĩa LB thạch + kanamycin (30 µg/ml) hoặc ampicillin (100µg/ml). Ủ ở 37°C qua đêm.

3.2.6.3. Chọn lọc dòng vi khuẩn tái tổ hợp có mang gene mong muốn

Trước tiên, chúng tôi dùng phương pháp PCR trên khuẩn lạc với mồi chung để chọn lọc các dòng có mang gene mong muốn.

Phản ứng PCR được tiến hành trong 25 µl: một ít tế bào từ khuẩn lạc, 12,5 µl PCR mastermix 2X (Promega), 0,5 µl T7 promoter/terminator primer (25 µM). Chu kỳ nhiệt: 95°C - 5 phút, 1 chu kỳ ; 94°C – 30 giây, 50°C - 30 giây, 72°C - 2 phút, 40 chu kỳ ; 72°C - 6 phút, 1 chu kỳ.

Kết quả PCR được phân tích trên gel agarose 1 %.

Bảng 2. Kích thước sản phẩm PCR dự đoán trên các vector tái tổ hợp.

Kí hiệu vector Kích thước sản phẩm dự đoán (bp)

pET-E7 598 pETM-E7 1659 pSUMO-E7 826 pGAT-E7 945 pET-p16INK4A 772 pETM-p16INK4A 1833 pSUMO-p16INK4A 1000 pGAT-p16INK4A 1119

20

Tiếp theo, những khuẩn lạc cho sản phẩm PCR dương tính phù hợp với kích thước dự đoán (bảng 2) được chọn để nuôi cấy và tách chiết plasmid. Plasmid tách chiết sau đóđược kiểm tra bằng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho từng gene. Thành phần phản ứng PCR tương tự như trên, trong đó bản mẫu là 1 µl DNA plasmid, 0,5 µl mồi đặc hiệu.

3.2.7. Phương pháp thu nhận – tinh sạch protein tái tổ hợp

Các plasmid tái tổ hợp mang gene mong muốn được biến nạp vào chủng vi khuẩn

E. coli BL21(DE3)pLysS.

Vi khuẩn được nuôi cấy trong5 mlmôi trường LB bổ sung kanamycin (30 µg/ml) hoặc ampicillin (100 µg/ml) ở 37°C, vận tốc lắc 250 vòng/phút. Bổ sung 25 µl IPTG (0,5

mM) khi dịch nuôi cấy đạt giá trị OD600 trong khoảng 0,6-1. Sau khi cảm ứng 4 giờ, sinh

khối vi khuẩn được thu nhận qua ly tâm (5000 vòng/phút - 5 phút). Huyền phù sinh khối trong 250 µl dung dịch ly giải (NaCl 50 mM, EDTA 1 mM pH 8). Tế bào vi khuẩn trong dịch huyền phù được phá vỡ bằng sóng siêu âm. Các phân đoạn được thu nhận qua ly tâm 13000 vòng - 30 phút - 4°C. Phần dịch nổi là phân đoạn protein biểu hiện ở pha tan trong tế bào chất được chuyển qua một eppendorf mới ; phần cặn là phân đoạn protein ở dạng thể vùi được hòa vào 250 µl dung dịch NaCl 50 mM, EDTA 1 mM pH 8.

Sau đó các phân đoạn được phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE. Thu nhận lượng lớn protein tái tổ hợp và tinh sạch

Cảm ứng 1 l dịch nuôi cấy vi khuẩn khi dịch nuôi cấy đạt được giá trị OD600 bằng

0,8 với IPTG 0,5 mM ở 37°C. Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn sau 6 giờ cảm ứng ở 5000 vòng/phút trong 5 phút. Huyền phù sinh khối trong 200 ml dung dịch gắn cột, bổ sung vào 1 ml lysozyme 10 mg/ml, ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Phá màng tế bào bằng sóng siêu âm ở điều kiện lạnh trên nước đá trong 10 giây, nghỉ 10 giây, lặp lại nhiều lần trong tổng thời gian là 1 giờ 30 phút. Ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4°C, thu phần dịch đồng nhất ở phía trên. Cân bằng cột His-trap FF crude (Amersham) bằng 5 ml dung dịch gắn cột (3.1.6.1). Nạp cột với 200 ml dịch đồng nhất thu được. Rửa cột bằng 20 ml dung dịch rửa cột (3.1.6.1). Dung ly bằng 5 ml dung dịch dung ly (3.1.6.1), thu dịch dung ly thành các phân đoạn 1 ml.

3.2.8. Phương pháp điện di SDS-PAGE

Trộn 40 µl dịch ly giải protein (3.1.6.1) với 10 µl dung dịch nạp mẫu 5X (3.1.6.1). Mẫu được đun ở 100°C - 10 phút, làm lạnh nhanh trong đá đang tan. Chuẩn bị gel

21

polyacrylamide có nồng độ acrylamide là 12 %. Nạp mẫu (10 µl/giếng) với 10 µl thang điện di protein. Điện di ở 100 V trong 2 giờ. Nhuộm (3.1.6.1) 30 phút, giải nhuộm.

3.2.9. Phương pháp Western blot

Sau điện di SDS-PAGE, phần gel phân tách được ngâm trong dung dịch điện chuyển (mục 1.6.1) trong 30 phút. Màng lai cắt góc và giấy thấm được ngâm trong nước cất 5 phút, rồi trong dung dịch chuyển màng ít nhất 15 phút. Tiến hành chuyển thẩm ở 110 V - 1 giờ 30 phút. Cho màng lai vào dung dịch khóa màng (3.1.6.1), ủ 40°C qua đêm. Tiếp tục ủ màng ở 4°C qua đêm với kháng thể sơ cấp (KTĐD kháng đặc hiệu các protein nghiên cứu) được pha loãng với tỉ lệ 1:1000 trong dung dịch khóa màng. Sau đó, rửa màng 4 lần bằng dung dịch TBST, mỗi lần 15 phút. Ủ màng với kháng thể thứ cấp kháng IgG chuột có đánh dấu HRP (horseradish peroxidase) ở nhiệt độ phòng trong 90 phút. Sau đó, rửa màng 6 lần bằng dung dịch TBST, mỗi lần rửa 15 phút. Màng lai được ủ với 1 ml dung dịch cơ chất của HRP (3.1.6.1) trong 5 phút. Ghi nhận tín hiệu bằng hệ thống thu hình Gel Doc - Biorad.

3.2.10. Phương pháp Bradford

Dựng đường chuẩn với dãy nồng độ dung dịch BSA (2 mg/ml) được tạo như sau :

µg/ml 0 25 50 75 100 125 150

BSA (µl) 0 12,5 25 37,5 50 62,5 75

PBS (µl) 1000 987,5 975 962,5 950 937,5 925

Để định lượng protein trong mẫu, cho vào mỗi giếng 160 µl dung dịch Bradford 1X. Bổ sung 40 µl mẫu vào mỗi giếng. Lắc 3 phút trên máy ELISA reader. Đo OD ở bước sóng 595 nm.

3.2.11. Phương pháp tạo KTĐD

Phương pháp bao gồm 4 bước : (1) gây đáp ứng miễn dịch chuột, (2) dung hợp tạo tế bào lai và chọn lọc dòng hybridoma sản xuất kháng thể mong muốn, (3) sản xuất và tinh sạch KTĐD, (4) kiểm tra một số đặc tính của KTĐD.

3.2.11.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột

Các protein tái tổ hợp E7 HPV16 và p16INK4A sau khi tinh sạch được sử dụng để

gây đáp ứng miễn dịch cho 3 chuột cái BALB/c 8 tuần tuổi (bảng 3).

Khả năng đáp ứng miễn dịch của chuột được đánh giá bằng phương pháp ELISA trực tiếp sử dụng protein tái tổ hợp làm kháng nguyên phủ giếng.

22

Bảng 3 . Quy trình gây đáp ứng miễn dịch chuột Ngày

thứ

Mũi tiêm Lượng kháng nguyên

(μg/150 μl/chuột)

Tá chất Vị trí tiêm

0 Mẫn cảm 40 μg CFA Ổ bụng

14 Tăng cường 1 20 μg IFA Ổ bụng

28 Tăng cường 2 20 μg IFA Ổ bụng

36 Thu nhận huyết thanh kiểm tra đáp ứng

42 Giai đoạn nghỉ trước khi tiêm mũi tăng cường cuối cùng 52 Tiêm mũi tăng cường

trước dung hợp

10 μg Không sử dụng

tá chất

Tĩnh mạch

55 Thu nhận tế bào lách

3.2.11.2. Dung hợp tạo tế bào lai (hybridoma)

 Chuẩn bị dòng tế bào u tủy (myeloma) cho dung hợp

Giải đông và nuôi cấy tế bào P3X63Ag8.653 trên môi trường RPM1640 trong bình Roux. Lô tế bào u tủy có tỉ lệ tế bào sống hơn 95 % được chọn để dung hợp.

Tỷ lệ tế bào sống được xác định bằng thử nghiệm Trypan blue.  Xác định tỉ lệ tế bào u tủy sống bằng phương pháp Trypan blue

Loại bỏ môi trường nuôi cấy trong bình Roux, rửa tế bào với 2 ml PBS 1X (-), bổ sung 2 ml Trypsin/EDTA vào bình nuôi, giữ trong 1 phút để tách tế bào. Huyền phù tế bào trong 1 ml môi trường, giữ dịch huyền phù trong eppendorf vô trùng. Hòa 15 µl dịch huyền phù tế bào vào 15 µl dung dịch Trypan blue, cho vào buồng đếm. Đếm số tế bào sống/ chết (tế bào chết bắt màu xanh).

 Thu nhận tế bào lách chuột :

Thu lách chuột vào đĩa Petri chứa môi trường RPMI 1640 không có huyết thanh.

Nghiền lách để thu tế bào, để yên ở 4C – 5 phút. Lọc qua lọc 70 m. Ly tâm dịch lọc

1200g – 10 phút. Thu cặn, hòa trong dung dịch NH4Cl 0,17 M lạnh, ủ 4C, 5-10 phút.

Thêm 50 ml PBS, ly tâm 1200g – 10 phút. Thu cặn, hòa trong 50 ml môi trường RPMI 1640 lạnh. Đếm số tế bào thu được, pha loãng bằng môi trường RPMI 1640 đến mật độ tế bào mong muốn.

 Dung hợp tế bào u tủy P3X63Ag8 với tế bào B từ lách chuột theo quy trình của Kohler và Misltein (1975).

23

Tế bào u tủy và tế bào lách được trộn chung với tỉ lệ 1:5 trong ống falcon 50 ml. Ly tâm 200 g - 7 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi và huyền phù cặn tế bào.Bổ sung 1

ml PEG 1500 đã ủ ấm ở 37oC bằng cách nhỏ từng giọt. Đặt ống falcon trong bể ổn nhiệt ở

37oC - 1 phút 30 giây. Thêm 20 ml PBS bằng cách nhỏ từng giọt.Sau 5 phút, tiến hành ly

tâm 1000 g - 5 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch nổi. Hòa cặn tế bào nhẹ nhàng trong môi trường RPMI 1640 20% FBS. Ly tâm 1000 g - 10 phút. Huyền phù cặn tế bào trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung HAT. Cho 100 µl dịch tế bào vào đĩa 96 giếng. Ủ

trong tủ ấm 37oC có bổ sung 5 % CO2.

Một tuần sau, bổ sung vào mỗi giếng trong đĩa 96 giếng 100 µl môi trường RPMI 1640 bổ sung HAT. Chọn lọc các dòng tế bào hybridoma phát triển được trên môi trường và khảo sát khả năng tạo KTĐD mục tiêu bằng phương pháp ELISA.

 Phân lập dòng hybridoma sản xuất kháng thể mục tiêu bằng pha loãng tới hạn

Tế bào trong các giếng cho tín hiệu dương tính với thử nghiệm ELISA được cấy chuyền và tiếp tục nuôi cấy trong đĩa 48 giếng, rồi đĩa 24 giếng và đĩa 6 giếng.Thu nhận và pha loãng tế bào trong môi trường RPMI 1640 để đạt mật độ 10 và 1 tế bào/giếng trên đĩa 96 giếng. Khi tế bào đạt độ phủ 70-80 % giếng, tiến hành kiểm tra lại khả năng sản

xuất KTĐD mục tiêu bằng thử nghiệm ELISA. Lặp lại quá trình trên thêm 1 lần nữa.

 Bảo quản dòng hybridoma

Tế bào hybridoma sản xuất KTĐD ổn định từ đĩa 96 giếng được lần lượt chuyển

sang nuôi cấy trong đĩa 48, 12 giếng và bình Roux 25 cm2. Dịch nuôi cấy có mật độ

5x106 tế bào được ly tâm 1200 g - 10 phút. Cặn tế bào được huyền phù nhẹ trong 1 ml

huyết thanh bào thai bò (FBS) có bổ sung 10 % DMSO. Chuyển 1 ml dịch huyền phù vào

ống bảo quản. Bảo quản tế bào ở -80oC, 1 ngày sau chuyển vào nitơ lỏng.

3.2.11.3. Sản xuất và tinh sạch KTĐD

Dòng hybridoma được nuôi cấy trong bình Roux 25 cm2 chứa môi trường DMEM

có nồng độ huyết thanh 10 %.Sau 1-2 tuần, tế bào được nuôi cấy ở thể tích lớn dần trong

bình Roux 75 cm2, 175 cm2. Khi tế bào phát triển đến giai đoạn bão hòa và bắt đầu chết

thì ly tâm môi trường nuôi cấy và thu dịch nổi.

Tinh sạch KTĐD từ dịch nổi :

Sau khi thu dịch nổi nuôi cấy tế bào lai, lấy mẫu dịch nổi đi xác định isotype của KTĐD bằng bộ Mouse Immunoglobulin Isotyping ELISA Kit (BD). Việc xác định isotype của KTĐD là cần thiết để lựa chọn phương pháp thu nhận kháng thể thích hợp.

24

Các KTĐD được sử dụng trong đề tài đều thuộc type IgG1 nên chúng tôi chọn protein G cho quá trình tinh sạch.

Cho 1 lít môi trường nuôi cấy hybridoma qua cột protein G-sepharose 1 ml (GE Health Care) đã được cân bằng. Rửa cột bằng 20 ml dung dịch PBS. Dung giải kháng thể bằng 10 ml glycine 0,2 M pH 2,8. Thu nhận 10 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml, vào eppendorf có chứa sẵn 30 μl dung dịch trung hòa.

KTĐD sau tinh sạch được thẩm tích và bảo quản trong PBS. Đo giá trị OD280 để

xác định hàm lượng kháng thể thu được theo công thức: Nồng độ KTĐD = OD280x 0,74.

3.2.12. Phương pháp ELISA

Có hai kiểu ELISA được sử dụng trong đề tài : ELISA trực tiếp và ELISA “sandwich”. ELISA trực tiếp được sử dụng để kiểm tra đáp ứng miễn dịch ở chuột, sàng lọc các dòng hybridoma sản xuất KTĐD mục tiêu và đo hằng số ái lực của KTĐD.

3.2.12.1. ELISA trực tiếp

Trong quy trình này, kháng nguyên được nhận biết trực tiếp bằng một cộng hợp “kháng thể đặc hiệu-enzyme” (hình 2A).

Phủ giếng trên đĩa 96 giếng với 50 µl kháng nguyên (5 µg/ml) ở 4oC qua đêm.

Khóa giếng bằng 200 µl dung dịch PBS-BSA 1 % ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ.Rửa giếng 6 lần bằng 200 µl dung dịch PBS-Tween 0,05 %.

Bổ sung 50 µl huyết thanh chuột, dịch chiết tế bàohoặc KTĐD ở các độ pha loãng khác nhau và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Rửa giếng 4 lần bằng 200 µl dung dịch PBS-Tween 0,05 %

Ủ giếng với 50 µl kháng thể đa dòng kháng IgG chuột đánh dấu alkaline phosphatase (1:1000) ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.

Rửa giếng 6 lần bằng 200 µl dung dịch PBS-Tween 0,05 % ; thêm 50 µl cơ chất

của alkaline phosphatase và ủ trong tối trong 30 phút, đo giá trị OD405.

Để xác định hằng số ái lực của KTĐD, phương pháp ELISA trực tiếp được thực

hiện như trêncó bổ sung những bước sau. Từ giá trị OD405 đo được, dựng đồ thị biểu diễn

giá trị OD của phản ứng ELISA theo các nồng độ kháng nguyên và KTĐD sử dụng. Hằng số ái lực được tính theo công thức (Beatty & cs, 1987) :

25

Trong đó Kaff : là hằng số ái lực của kháng thể

[Ab1] và [Ab2] : nồng độ của KTĐD cho giá trị OD bằng 50% giá trị OD bão hòa, tương ứng với các nồng độ kháng nguyên phủ giếng khác nhau.

n : hệ số pha loãng của 2 nồng độ kháng nguyên sử dụng

Hằng số ái lựccủa KTĐD được tính là giá trị trung bình của 6 cặp số tương ứng với 6 tổ hợp của 4 nồng độ kháng nguyên sử dụng.

3.2.12.2. ELISA “sandwich”

Trong kỹ thuật này, kháng nguyên nằm “kẹp” (sandwich) giữa một kháng thể bắt giữ và một kháng thể nhận biết đặc hiệu ; sau đó kháng thể đặc hiệu sẽ được nhận biết bằng một cộng hợp “kháng thể thứ cấp nhận biết kháng thể nhận biết-enzyme” (hình 2C).