Đối với protein p16INK4A-SUMO, sau khi cắt loại đuôi dung hợp, cần phải tinh
sạch trở lại. Trong thành phần phản ứng cắt có sử dụng DTT có tác dụng biến tính protein tạo thuận lợi cho hoạt động của SUMO protease. Tuy nhiên, DTT lại là một chelator của cột HisTrap FF, nên để giảm ảnh hưởng của DTT lên cột, chúng tôi khảo sát thêm chất biến tính protein khác là beta-mercaptoethanol. Theo khuyến cáo của nhà sản xuất cột HisTrap FF thì nồng độ DTT < 5 mM và nồng độ beta-mercaptoethanol < 20 mM.
Kết quả điện di SDS-PAGE (hình 23) cho thấy khi sử dụng chất biến tính là beta- mercaptoethanol, sản phẩm thủy giải là giống nhau cho tất cả các nồng độ sử dụng, và rõ hơn khi sử dụng chất biến tính là DTT. Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant cho thấy hiệu suất cắt cao nhất (94 %) khi thực hiện phản ứng cắt với sự hiện diện của 2-mercaptoethanol ở nồng độ 5 mM (bảng 17). Đây là nồng độ được sử dụng cho các thử nghiệm tiếp theo.
Hình 23. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2 chất biến tính protein: (A), DTT (B), 2-
mercaptoethanol.Giếng 1:Thang phân tử lượng protein;giếng 2:protein p16INK4A ở trạng thái
dung hợp với đuôi SUMO;giếng 3:sản phẩm của phản ứng cắt không có sự hiện diện của chất biến tính;giếng 4,5,6,7:sản phẩm của phản ứng cắt có sự hiện diện của DTT ở các nồng độ 0,5mM, 1,0mM, 2,0mM, 4,0mM; giếng 8,9,10,11:sản phẩm của phản ứng cắt có sự hiện diện
của beta-mercaptoethanol ở các nồng độ 5mM, 10mM, 15mM, 20mM.
2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1
51
Bảng 17. Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant hiệu suất của phản ứng cắt.
DTT 2-Mercaptoethanol 0.25mM 92% 5mM 94% 0.5mM 92% 10mM 90% 1mM 88% 15mM 87% 2mM 86% 20mM 84% 4mM 80%