Phương pháp hóa tếbào miễn dịch (immunocytochemistry)

Phương pháp hóa tế bào miễn dịch được sử dụng để phát hiện biểu hiện các gene mục tiêu trong tế bào nuôi cấy và trong bệnh phẩm.

3.2.14.1.Phương pháp nhuộm miễn dịch tế bào trên lamelle

Đây là phương pháp phát hiện protein mục tiêu trong tế bào nuôi cấy (CHO,

HeLa). Phủ 2x105 tế bào trên lamelle và ủ ở 37C qua đêm. Rửa lamelle 2 lần với dung

dịch PBS. Cố định tế bào trên lamelle bằng 1,5 ml PFA 3 % - 10 phút ở nhiệt độ phòng. Làm thấm màng tế bào bằng 1,5 μl dung dịch PBS-triton X100 0,5 % trong 15 phút ở

27

nhiệt độ phòng. Rửa lamelle 2 lần với dung dịch PBS. Ủ lamelle với H2O2 3 % trong 10

phút, nhiệt độ phòng. Rửa PBS 2 lần. Khóa lamelle bằng 1,5 ml sữa gầy 5 % trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Pha loãng kháng thể sơ cấp trong dung dịch PBS- saponin 0,05 %. Ủ

với 250 μl kháng thể sơ cấp qua đêm ở 4C. Rửa lamelle 3 lần (5 phút /lần) với dung dịch

PBS- Tween 0,1 %.

 Phát hiện huỳnh quang: Ủ lamelle với 250 μl kháng thể thứ cấp đánh dấu TRITC đối

với phát hiện bằng huỳnh quang trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa lamelle 3 lần (5 phút /lần) với dung dịch PBS- Tween 0,1 %. Nhuộm tương phản với Hoechst, quan sát dưới

kính hiển vi huỳnh quang ở vật kính 20X.

 Phát hiện màu: Ủ lamelle với 250 μl kháng thể thứ cấp cộng hợp HRP trong 1 giờ ở

nhiệt độ phòng. Rửa lamelle 3 lần (5 phút /lần) với dung dịch PBS- Tween 0,1 %. Bổ sung 300 μl cơ chất DAB (Sigma) và cho hiện màu ở các mẫu. Rửa lại bằng PBS để dừng phản ứng. Cố định lamelle lên phiến kính, quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 20 X.