4.9.2.1. Độ đúng
Tương tự như đối với kit KTE7-16ICC, do không có “chuẩn vàng” để xác nhận sự hiện diện của protein E7 HPV 18 trong mẫu thử, độ đúng của kit KTE7-18ICC được xác định gián tiếp thông qua kết quả định týp HPV với kit Amplisense HPV Typing.
Thử nghiệm định týp được tiến hành ở PTN công ty Khoa Thương còn thử nghiệm HTBMD E7 HPV 18 được tiến hành tại BV Hùng Vương.
Số lượng mẫu sử dụng cho thử nghiệm là 51 mẫu tế bảo cổ tử cung bảo quản trong dịch ThinPrep.
109
Bảng 24. Kết quả hóa miễn dịch tế bào E7 HPV 18 so với kết quả định týp HPV
Định týp HMDTB Týp HPV 18 Khác (-) E7 HPV 18 (+) 5 7 14 (-) 3 10 13
Kết quả (bảng 24, phụ lục 48, 49) cho thấy :
Kết quả phù hợp trên 27 mẫu (53 %), trong đó có 4 mẫu (+) và 23 mẫu (-).
Kết quả không phù hợp trên 24 mẫu (47 %), trong đó :
(1) HPV định týp 18 / HTBMD (-) : 3 mẫu (2) HPV định týp khác / HTBMD (+) : 8 mẫu (3) HPV định týp (-) / HTBMD (+) : 14 mẫu Nhận xét :
(1) Đối với ba trường hợp HPV định týp là 18 nhưng kết quả HTBMD (-), tuy có ít dữ liệu hơn so với HPV 16 nhưng có công bố cho thấy không phải 100 % các trường hợp định týp 18 đều cho kết quả miễn dịch dương tính, chỉ 45 % dương tính với kháng thể kháng E7 HPV 18 được phát hiện ở các trường hợp nhiễm HPV (Rosales & cs, 2001). Như vậy, ba trường hợp này có thể rơi vào nhóm âm tính theo công bố trên.
(2) (3) Trong 8 mẫu định týp khác mà HTBMD cho kết quả (+) chỉ có 1 mẫu nhiễm HPV týp 59 là thuộc cùng nhóm phụ với HPV 18 và có khả năng cho phản ứng chéo. Kết quả trên 14 mẫu HPV (-) hay 7 mẫu HPV týp khác mà HTBMD (+) cho thấy có thể có tương tác không đặc hiệu giữa KTĐD 1D5 nhận biết E7 HPV 18 với một số thành phần trong tế bào cổ tử cung. Theo một số công bố trước đây, protein E7 HPV có kích thước nhỏ và có khả năng tương tác với nhiều protein tế bào, đăc biệt ở vùng đầu carboxy. Vùng này có chức năng dimer hóa hay multimer hóa. Có khả năng vùng này của protein E7 có mức độ tương đồng nhất định với những vùng có khả năng multimer hóa với E7 của nhiều protein khác. Như vậy, một KTĐD nhận biết epitope thuộc vùng này trên protein E7 cũng có thể nhận biết cả những vùng tương đồng trên các protein nội bào khác (Munger & cs, 2001 ; White & cs, 2011). Có thể đó là lý do dẫn đến tình trạng nhận biết không đặc hiệu của KTĐD nhận biết E7 HPV 18 trong đề tài này.
110
4.9.2.2. Độ chính xác
Để khảo sát độ chính xác của kit KTE7-18ICC, chúng tôi tiến hành hai loạt thí nghiệm. Loạt I nhằm xác định độ lặp lại nội phản ứng, loạt II nhằm xác định độ lặp lại liên phản ứng.
Hình 82. Tế bào HeLa (A) và MCF-7 (B) nhuộm miễn dịch ở các lần thử nghiệm khác nhau (1) (2)(3) tại Công ty Khoa Thương
Loạt thí nghiệm I nhằm xác định độ lặp lại nội phản ứng được tiến hành tại PTN
công ty Khoa Thương. Mẫu sử dụng là tế bào HeLa với mật độ là 106 tế bào/ml. Trong
loạt thí nghiệm này, kết quả được xác định dựa trên quan sát dưới kính hiển vi về sự hiện diện của tế bào nhuộm màu nâu, đồng thời cường độ nhuộm miễn dịch cũng được đánh giá một cách chủ quan là cao +++, trung bình ++ và thấp +.
Kết quả (hình 83) cho thấy ở hai lần lặp lại, tế bào HeLa nhuộm miễn dịch dương tính với KTĐD 1D5. Cường độ tín hiệu nhuộm miễn dịch giống nhau trong hai lần thử nghiệm (++) nhưng cường độ nhuộm tương phản với hematoxylin không đồng đều.
111
Loạt thí nghiệm II nhằm xác định độ lặp lại liên phản ứng được tiến hành tại hai địa điểm : BV Hùng Vương và PTN công ty Khoa Thương. Mẫu sử dụng tương tự như trên. Kết quả cũng được xác định dựa trên quan sát dưới kính hiển vi về sự hiện diện của tế bào nhuộm màu nâu, đồng thời cường độ nhuộm miễn dịch cũng được đánh giá một cách chủ quan là cao +++, trung bình ++ và thấp +.
Hình 83. Tế bào HeLa (A) và MCF-7 (B) nhuộm miễn dịch ở hai đơn vị : Khoa Thương (1) và BV Hùng Vương (2)
Kết quả (hình 84) cho thấy ở hai lần lặp lại, các mẫu tế bào HeLa nhuộm miễn dịch ở cả hai đơn vị đều cho kết quả dương tính. Tuy nhiên, tín hiệu nhuộm tương phản có cường độ khác nhau. Chúng tôi nhận thấy trong quy trình HTBMD tiến hành ở hai nơi này, bước “bộc lộ kháng nguyên” là bước khác biệt quan trọng ; trong đó tác nhân nhiệt có thể được cung cấp qua bể ủ ổn nhiệt, đun cách thủy trên bếp điện hoặc dùng lò vi ba. Điều này phù hợp với những công bố trước đây về vai trò của bước “bộc lộ kháng nguyên” trong quy trình hóa tế bào/mô miễn dịch (McNicol & Richmond, 1998). Kết quả tốt nhất trong thử nghiệm của chúng tôi đạt được là khi sử dụng bể ổn nhiệt.
4.9.2.3. Độ đặc hiệu phân tích
Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu phân tích của KTĐD 1D5 bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang được tiến hành trước tiên trên tế bào CHO-K1/EGFP có chuyển gene E7 thông qua vector pEGFP-E7. Tế bào CHO-K1 tái tổ hợp sẽ biểu hiện protein E7 HPV
112
18 ở dạng dung hợp với protein phát huỳnh quang GFP (Green Fluorescent Protein). Chứng âm là tế bào CHO-K1/EGFP chỉ nhận vector pEGFP không gắn thêm E7. Kháng thể thứ cấp là kháng thể nhận diện 1D5 và được đánh dấu bằng TRITC, có bước sóng kích thích là 514 nm. Như vậy, tế bào không tái tổ hợp CHO-K1/EGFP sẽ phát huỳnh quang xanh lục khi được kích thích ở bước sóng 488 nm trong khi tế bào tái tổ hợp CHO- K1/EGFP-E7sẽ phát huỳnh quang màu đỏ ở 514 nm.
Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang(hình 85) cho thấy KTĐD 1D5 nhận biết đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp biểu hiện trong tế bào CHO-K1/EGFP-E7.
Phương pháp tương tự được tiến hành trên tế bào HeLa là tế bào biểu hiện tự nhiên protein E7; với chứng âm là tế bào ung thư biểu mô phổi Beas-2B.
Hình 85. Tế bào HeLa và Beas-2B nhuộm miễn dịch huỳnh quang với 1D5 (40X). A1, A2, A3: tếbào HeLa với 10 μg/ml kháng thểIgG1 chuột (A1), 10 μg/ml KTĐD 1D5 (A2), 10 μg/ml KTĐD 4H5 (A3). B1, B2, B3: tế bào Beas-2B với 10 μg/ml kháng thểIgG1 chuột (B1), 10 μg/ml KTĐD 1D5 (B2), 10 μg/ml KTĐD 4H5 (B3).
Hình 84. Tế bào CHO-K1/EGFP và CHO-K1/EGFP-E7 nhuộm miễn dịch huỳnh quang với KTĐD 1D5 quan sát ở bước sóng 488 và 541 nm (100X)
113
Kết quả (hình 86) cho thấy KTĐD 1D5 cho kết quả nhuộm miễn dịch dương tính với tế bào HeLa và âm tính với tế bào Beas-2B
Tóm lại, KTĐD 1D5 nhận biết đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp và kháng nguyên tự nhiên E7 HPV 18.
4.9.2.4. Khả năng triển khai đại trà kit tại cơ sở y tế
Kit KTE7-18ICC có ưu điểm là độ chính xác bao gồm độ lặp lại nội và liên phản ứng tốt. Tuy nhiên kit này có nhiều nhược điểm : Độ đúng so với kết quả định týp HPV thấp. Độ đặc hiệu phân tích tốt trên các tế bào chứng dương và âm ; nhưng khi sử dụng kit trên tế bào cổ tử cung thì chúng tôi nhận được tỉ lệ cao kết quả dương tính không đặc hiệu. Bên cạnh đó, kit này cũng có bị giới hạn bởi sự hiện diện của týp HPV trong bệnh phẩm. Tuy có tần suất cao hơn đôi chút so với HPV 16 trong cộng đồng nhưng kit này cũng không có giá trị chẩn đoán lâm sàng tốt như test định týp HPV.
Nhìn chung, kit KTE7-18ICC không thể được triển khai cho ứng dụng thực tế.