Chúng tôi khảo sát các nồng độ khác nhau của tác nhân “khóa” giếng là DNA tinh trùng cá hồi (0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml, 1 mg/ml) bổ sung vào dung dịch “khóa” giếng là sữa gầy 5 % để làm giảm tín hiệu nền của phản ứng.
Đồng thời, chúng tôi khảo sát số chu kì PCR, trong khoảng 30 đến 40 chu kì, để làm tăng độ nhạy của quy trình mà không làm gia tăng tín hiệu nền.
Hình 54. Sản phẩm PCR với các tác nhân khóa giếng và số chu kì PCR khác nhau. 1-6 : Sữa gầy 5 % bổ sung DNA tinh trùng cá hồi với nồng độ từ 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0.6
mg/ml, 0,8 mg/ml, 1 mg/ml. a : PCR 30 chu kì, b : PCR 40 chu kì. a, b : 0 µg/ml E7 HPV 18
Kết quả (hình 54) cho thấy không có sự khác biệt về tín hiệu nền khi tăng nồng độ DNA tinh trùng cá hồi. Nên chúng tôi quyết định sử dụng nồng độ thấp nhất là 0,1 mg/ml để bổ sung vào dung dịch “khóa” giếng. Khi tăng từ 30 chu kì PCR lên 40 chu kì, tín hiệu nền tăng mạnh. Do đó, chúng tôi sử dụng PCR 30 chu kì cho quy trình immunoPCR.
Tóm lại, các thông số của quy trình immunoPCR được xác định bao gồm :
Nồng độ các kháng thể sử dụng cho quy trình là :
- 20 µg/ml đối với kháng thể 1D5 phủ giếng - 5 µg/ml KTĐD phát hiện 4H5-biotin
- 10 µg/ml streptavidin và 25 pg/ml DNA đánh dấu biotin
Tác nhân block giếng là sữa gầy 5 %, bổ sung 0,1 mg/ml DNA tinh trùng cá hồi
75