Sau khi nồng độ các kháng thể sử dụng trong quy trình ELISA sử dụng kháng thể 1C10 làm tác nhân “bắt giữ”đã được tối ưu hoá, tín hiệu nền khi không có kháng nguyên vẫn còn khá cao. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát một số tác nhân “khoá” giếng nhằm làm giảm tín hiệu nền mà không ảnh hưởng đến độ nhạy của quy trình. Các tác nhân “khoá” giếng thường được sử dụng là BSA, FBS, sữa gầy, gelatin, casein; trong đó sữa gầy và gelatin khó bảo quản ở dạng lỏng và không thuận tiện cho sử dụng. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát hai tác nhân “khóa” giếng là BSA và FBS. Nồng độ khảo sát là 5 %, 2,5 %, 1 % đối với BSA, 10 %, 5 % đối với FBS, đây cũng các nồng độ được khuyến
92
cáo sử dụng đối với hai loại tác nhân này (KPL "ELISA Technical Guide"). Các thông số như nồng độ kháng thể “bắt giữ” 1C10 là 2,5 µg/ml, kháng thể “phát hiện” là 1,6 µg/ml,
kháng thể “cộng hợp HRP”pha loãng 1/2000 và kháng nguyên p16INK4A được pha loãng
bậc 10 theo hàng từ 10 µg/ml – 10 pg/ml.
Nồng độ tác nhân “khóa” giếng tối ưu là nồng độ mà ở đó nồng độ kháng nguyên mục tiêu thấp nhất còn cho kết quả dương tính, nghĩa là có giá trị nằm trên giá trị “ngưỡng”. Trong trường hợp này, giá trị “ngưỡng” là 0,25 (phụ lục 32).
Hình 77. Giá trịOD450 ở các nồng độ tác nhân khoá giếng BSA và FBS khác nhau
Kết quả (hình 77, phụ lục 21) cho thấy nồng độ p16INK4A tái tổ hợp thấp nhất cho
giá trị OD450 lớn hơn giá trị ngưỡng, khi sử dụng các tác nhân “khóa” giếng BSA và FBS
ở các nồng độ khác nhau, lần lượt là 1 ng/ml với BSA 1% , 100 pg/ml với BSA 2,5 %, 1 ng/ml với BSA 5 %, 1 ng/ml với FBS 5 % và 100 ng/ml với FBS 10 %. Như vậy, tác nhân khoá giếng tối ưu là BSA 2,5 %.
Tóm lại, các thông số tối ưu cho quy trình ELISA phát hiện p16INK4A là :
Nồng độ kháng thể “bắt giữ” :2,5 µg/ml (1C10) và 2,0 µg/ml (JC8)
Độ pha loãng kháng thể “phát hiện” : 1/120 (1C10) và 1/60 (JC8)
Độ pha loãng kháng thể “cộng hợp HRP” : 1/2000
Loại và nồng độ tác nhân “khóa” giếng : BSA 2,5 %.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 10 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 1E-05 0 O D A 4 5 0
Nồng độ protein p16INK4Atái tổ hợp (µg/ml)
93
Sau khi xây dựng và tối ưu hóa quy trình, chúng tôi tạo kit và xác định hiệu lực hoạt động (validation) của các kit tạo được.
Các nguyên tắc chung cho việc xây dựng các kit miễn dịch được thực hiện dựa trên các khuyến cáo của CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) của Hoa Kỳ ; riêng đối với kit hóa tế bào miễn dịch, chúng tôi tham khảo khuyến cáo của CDRH (Center for Devices and Radiological Health) thuộc Tổ chức FDA (Food and Drug Administration) Hoa Kỳ ; còn kit ELISA được xây dựng dựa trên một số công trình (Jacobson, 1996 ; Crowther & cs, 2006 ; Crowther JR, 2009).
Việc xây dựng kit bao gồm các nội dung : (1) Tạo kit (hộp chứa, thành phần và số lượng phản ứng/kit, bản hướng dẫn sử dụng, phần mềm lưu kết quả); (2) đánh giá hiệu quảhoạt động của kit (validation) thông qua việc xác định độ đúng, độ chính xác, độ đặc hiệu phân tích, độ nhạy phân tích, giá trị ngưỡng, độ ổn định; (3) khảo sát khả năng triển khai đại trà kit tại các cơ sở y tế.
Trong các nội dung trên, việc đánh giá hiệu quả hoạt động của kit có vai trò quyết định. Trong đánh giá hiệu quả hoạt động của kit, chúng tôi sử dụng một số khái niệm với các định nghĩa như sau:
Độ đúng (accuracy) : mức độ phù hợp giữa kết quả thu được của thử nghiệm
với kết quả thật của chất/phân tử cần đo lường. Kết quả thật thường được xác định thông qua “chuẩn vàng” (gold standard), được định nghĩa là phương pháp cho kết quả hoàn toàn đúng. Đối với tác nhân truyền nhiễm, “chuẩn vàng” là các phương pháp nuôi cấy, phân lập, định danh. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, các phương pháp vừa nêu không khả thi, như đối với một số virus không nuôi cấy được - HBV, HCV, HPV, … Mặt khác, nhiều “chuẩn vàng” cho thấy những hạn chế lớn về độ lặp lại và độ chính xác. Do đó, người ta đề xuất khái niệm “chuẩn tương đối” (relative standards) (Jacobson, 1996), hình thành từ kết quả tổng hợp của nhiều thử nghiệm khác.
Trong đề tài này, do không có “chuẩn vàng” nên chúng tôi xác định độ đúng của kit bằng cách so sánh kết quả thu nhận từ kit với kết quả từ một số thử nghiệm khácsử dụng phương pháp tương tự kit nhưng với những chất/phân tử khác. Những chất/phân tử này là những chất/phân tử phải đã được chứng minh là có hiệu quả hoạt động tốt.
Độ chính xác (precision) : mức độ giống nhau giữa các kết quả từ những lần
thử nghiệm độc lập. Độ chính xác thường được phân thành : (1) độ lặp lại nội phản ứng (“within-run” hay “repeatability”) là độ lặp lại giữa những thử nghiệm trong cùng điều
94
kiện, thường được xác định từ kết quả 03 lần lặp trong một lần chạy ; (2) độ lặp lại liên phản ứng (reproducibility) là độ lặp lại của những thử nghiệm được tiến hành trong những điều kiện khác nhau (lô kit, lần chạy, ngày chạy, thời gian chạy, người thao tác, …), thường được xác định từ 03 lần chạy ở 03 ngày khác nhau. Số mẫu khuyến cáo là ít nhất 10 mẫu, mỗi mẫu được lặp hai lần để có tổng cộng ít nhất là 20 mẫu cho mỗi lần thử.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng một phổ pha loãng của dịch tế bào nuôi cấy biểu hiện dương tính với chất/phân tử mục tiêu và/hoặc của kháng nguyên tái tổ hợp mục tiêu cho các lần lặp.
Độ đặc hiệu phân tích (analytyical specificity) : mức độ phản ứng chéo của
thử nghiệm với các chất/phân tử khác, không phải là chất/phân tử cần đo. Độ đặc hiệu phân tích có thể được xác định bằng cách sử dụng mẫu có chứa những chất/phân tử có khả năng cho phản ứng chéo với chất/phân tử cần xác định.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng các dòng tế bào nuôi cấy có và không có biểu hiện các kháng nguyên mục tiêu cho nội dung này.
Độ nhạy phân tích (analytical sensitivity) : hàm lượng nhỏ nhất của chất/phân
tử cần đo mà thử nghiệm có thể xác định được. Độ nhạy phân tích có thể được xác định bằng cách phân tích phổ các bậc pha loãng của chất/phân tử cần đo cho đến khi thử nghiệm không cho kết quả đọc được nữa.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phổ pha loãng của các kháng nguyên mục tiêu cho nội dung này
Giá trị “ngưỡng” (cut-off value) : Giá trị “ngưỡng” được sử dụng để phân
định kết quả dương tính hay âm tính của một thử nghiệm ELISA. Giá trị này được xác định bằng các phương pháp thống kê trên một quần thể mẫu đại diện. Do vậy, việc xác định cỡ mẫu và loại mẫu là những yếu tố quan trọng để xác định giá trị “ngưỡng” của thử nghiệm. Theo Frey và cộng sự (1998), luật phân phối Student được sử dụng để ước lượng cỡ mẫu dùng trong xác định giá trị “ngưỡng”, trong đó cỡ mẫu tối thiểu sử dụng là 30 mẫu âm tính. Có hai cách xác định giá trị ngưỡng thông dụng.
Cách đơn giản là xác định giá trị “ngưỡng” bằng 2-3 lần độ lệch chuẩn (SD- Standard Deviation) của nhóm kết quả âm tính.
Giá trị “ngưỡng” = trung bình giá trị tín hiệu của mẫu âm + 3* STD của mẫu âm Cách thứ hai sử dụng đường cong ROC (Receiver operating characteristics), trong đógiá trị “ngưỡng” được xác định trong mối tương quan giữa độ nhạy và độ đặc hiệu của
95
quy trình. Độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình được thể hiện trên đồ thị đường cong ROC. Từ đó, giá trị “ngưỡng” tối ưu có thể được xác định từ việc phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng với các giá trị “ngưỡng” khác nhau. Các dữ liệu được tính toán và xử lý bằng chương trình GraphPad Prism 5.0.
Trong phân tích đường cong ROCcó một giá trị phản ánh mối tương quan giữa độ nhạy và độ đặc hiệu có tên là AUC (area under the curve). Theo đó, nếu giá trị AUC nằm trong khoảng 90 %-100 % thì thử nghiệm được xem là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, còn giá trị AUC nhỏ hơn 50 % thì thử nghiệm được xem là có tính chính xác thấp.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng cả hai cách tính trên để xác định giá trị “ngưỡng”.
Độ ổn định (stability) : là khả năng hiệu quả hoạt động của kit được giữ ổn
định dưới tác động của một số yếu tố ngoại cảnh. Để hướng đến việc thương mại hóa kit trong tương lai, chúng tôi khảo sát tính ổn định của kit theo thời gian bảo quản và theo lô sản xuất.