Theo khuyến cáo của Hội các nhà bệnh học Canada (Torlakovic & cs, 2010), việc xác định hiệu quả hoạt động một thử nghiệm hóa tế bào/mô miễn dịch được thực hiện dựa trên việc sử dụng những dòng tế bào hay mô đã được xác định rõ đặc tính, và được xử lý giống như mẫu nghiên cứu. Những dòng tế bào hay mô này phải được xác định chắc chắn là có hay không có biểu hiện protein mục tiêu. Do đó, để xác định độ đặc hiệu phân tích
105
của kit KTE7-16ICC, chúng tôi khảo sát khả năng phản ứng đặc hiệu của KTĐD 2C1 với các dòng tế bào đã được chứng minh là có và không biểu hiện protein E7 HPV 16.
Trước tiên, chúng tôi tạo dòng tế bào CHO-K1 tái tổ hợp mang gene E7 HPV 16, đặt tên là CHO-K1/EGFP-E7-16 và sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang để kiểm tra hoạt động của KTĐD 2C1 trên tế bào CHO-K1/EGFP-E7-16 biểu hiện nhân tạo E7 HPV 16.
Sau đó, chúng tôi tiếp tục kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên của 2C1 trên dòng tế bào CaSki có biểu hiện tự nhiên proteinE7 HPV 16.
Dòng tế bào C-33 A được dùng làm chứng âm (Lee & cs, 2004) vì đây là dòng tế bảo ung thư cổ tử cung không chứa DNA bộ gene HPV.
Tính đặc hiệu của KTĐD 2C1 trên tế bào CHO-K1 tái tổ hợp
Phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang được tiến hành trên tế bào CHO-K1 chuyển gene mã hóa cho protein E7 HPV 16ở dạng dung hợp với protein phát huỳnh quang GFP (Green Fluorescent Protein) phát tín hiệu huỳnh quang xanh lục ở 488 nm. Chứng âm cho thí nghiệm là dòng tế bào CHO-K1 được chuyển vector pEGFP-C2 chỉ biểu hiện protein GFP, được đặt tên là CHO-K1/EGFP-C2. Các tế bào được nhuộm bổ sung với chất nhuộm DNA là Hoechst phát huỳnh quang màu xanh dương. Liên kết KTĐD với kháng nguyên được nhận biết thông qua tín hiệu huỳnh quang màu đỏ cam khi quan sát ở bước sóng kích thích của TRITC là 541 nm.
Các dòng tế bào CHO-K1/EGFP-C2 và CHO-K1/EGFP-E7-16 được lai miễn dịch huỳnh quang với KTĐD 2C1, đồng thời với kháng thể thương mại (Santa Cruz) kháng E7 HPV 16 dùng làm chứng dương. Kháng thể thứ cấp phát hiện KTĐD được đánh dấu bằng TRITC.
Kết quả cho thấy ở bước sóng kích thích là 488 nm, tế bào CHO-K1/EGFP-C2 (hình 81 B2, D2) và CHO-K1/EGFP-E7-16 (hình 81 A2 và C2) đều phát huỳnh quang xanh của GFP. Ở bước sóng kích thích là 541 nm của TRITC, chỉ có tế bào CHO- K1/EGFP-E7-16 mới cho tín hiệu dương tính với KTĐD 2C1 (hình 81 A3) hoặc kháng thể thương mại (hình 81 C3). Tín hiệu dương tính không xuất hiện khi lai KTĐD 2C1 và kháng thể thương mại với tế bào CHO-K1/EGFP-C2 (hình 81 A2 và C2).
Kết quả trên cho thấy KTĐD 2C1 tương tác đặc hiệu với protein E7 HPV 16 được biểu hiện bởi hệ thống biểu hiện của tế bào động vật hữu nhũ chuyển gene.
106
Hình 80. Kết quả miễn dịch huỳnh quang trên tế bào CHO-K1/EGFP-E7-16, CHO-K1/EGFP- C2 với KTĐD 2C1 quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (20X) ở bước sóng 541 nm và 488
nm. A1, B1: tế bào CHO-K1/EGFP-E7-16 và CHO-K1/EGFP-C2 nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst. A2, B2: tín hiệu huỳnh quang GFP ở bước sóng 488 nm. A3, B3: tín hiệu lai với KTĐD
kháng E7 HPV-16 ở bước sóng 541 nm. A4, B4: hình kết hợp. C1, D1: tế bào CHO-K1/EGFP- E7-16 và CHO-K1/EGFP-C2 nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst. C2, D2: tín hiệu huỳnh quang GFP ở bước sóng 488 nm. C3, D3: tín hiệu lai với KTĐD kháng E7 HPV-16 thương mại (Santa
Cruz) ở bước sóng 541 nm. C4, D4: hình kết hợp.
Tính đặc hiệu của KTĐD 2C1 trên dòng tế bào CaSki
Tiếp theo,chúng tôi kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD 2C1 với protein E7 HPV 16 biểu hiện tự nhiên trong tế bào CaSki, với dòng tế bào C-33A dùng làm chứng âm. Kháng thể thứ cấp là kháng thể thỏ đặc hiệu cho IgG chuột được cộng hợp với TRITC.
Kết quả cho thấy không có tín hiệu dương tính trên tế bào C-33A với cả KTĐD 2C1 lẫn KTĐD thương mại (hình 82 B2, D2).
Trong khi đó, tế bào CaSki tương tác với KTĐD 2C1 (Hình A2) cho tín hiệu huỳnh quang đỏ/cam của TRITC, tín hiệu này vừa có phần trùng lắp vừa có phần không
107
trùng lắp với tín hiệu huỳnh quang màu xanh của Hoechst (hình 82 A3) và chúng tôi cũng thu nhận được kết quả tương tự với KTĐD thương mại. Kết quả này cho thấy KTĐD 2C1 tương tác đặc hiệu với protein E7 HPV 16 biểu hiện cả trong nhân và tế bào chất của tế bào CaSki, với biểu hiện mạnh hơn trong nhân. Điều này phù hợp với kết quả mà Dreier và cộng sự (2011) đã công bố. Nhóm nghiên cứu này khi sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đa dòng thỏ kháng E7 HPV 16 đã ghi nhận ở hầu hết tế bào CaSki, protein E7 được phát hiện thấy cả trong nhân và trong tế bào chất.
Hình 81. Kết quả miễn dịch huỳnh quang trên tế bào CaSki, C-33 A với KTĐD 2C1 quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (20X) ở bước sóng 541 nm và 488 nm. A1, B1: tế bào CaSki, C-
33 A nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst. A2, B2: tín hiệu với KTĐD kháng E7 HPV-16 dòng 2C1 ở bước sóng 541 nm. A3, B3: hình kết hợp. C1, D1: tế bào CaSki, C-33 A nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst. C2, D2: tín hiệu với KTĐD kháng E7 HPV-16 thương mại (Santa Cruz) ở bước
sóng 541 nm. C3, D3: hình kết hợp.
Kết quả trên cho thấy KTĐD 2C1 kháng protein E7 HPV 16 tương tác đặc hiệu với kháng nguyên ở dạng cấu hình tự nhiênbiểu hiện trong tế bào CHO-K1 tái tổ hợp và trong dòng tế bào CaSki.
108
4.9.1.4. Khả năng triển khai đại trà kit tại cơ sở y tế Kit KTE7-16ICC có những ưu điểm :