Để duy trì hiệu quả hoạt động của KTĐD đặc hiệu, chúng tôi khảo sát một số hóa chất được xem như có khả năng ổn định kháng thể như trehalose, sucrose và glycerol. Trehalose, sucrose và glycerol là ba chất thông dụng được sử dụng để ổn định cấu trúc và hoạt tính của protein. Nồng độ trehalose, sucrose thường được sử dụng từ 0,1 M đến 0,3 M trong các chất bảo quản protein (Schiffter, 2011 ; Wang & cs, 2007). Glycerol thường được sử dụng trong khoảng nồng độ 25 % - 50 % (Vagenende & cs, 2009 ; Wang & cs, 2007). Do đó, chúng tối chọn nồng độ khảo sát là 0,1 M, 0,25 M, 0,5 M đối với trehalose, và sucrose. Đối với glycerol, các nồng độ khảo sát là 10 %, 25 %, 50 %.
Các dung dịch ổn định kháng thể được sử dụng có các thành phần như sau:
- Dung dịch 1, 2, 3 : có thành phần chung là TBS 1X, sodium nazide 0,05%, BSA 0,5% pH 7,4, cộng thêm với các nồng độ khác nhau của trehalose lần lượt là 0,1 M, 0,25 M và 0,5 M.
- Dung dịch 4, 5, 6 : có thành phần chung giống như trên cộng thêm với các nồng độ sucrose khác nhau lần lượt là 0,1M, 0,25 M và 0,5 M.
- Dung dịch 7, 8, 9 : có thành phần chung giống như trên cộng thêm với các nồng độ glycerol khác nhau lần lượt là 10 %, 24 % và 50 %.
- Dung dịch 10 : chỉ bao gồm các thành phần chung như trên.
- Dung dịch 11 : bao gồm các thành phần chung như trên nhưng thiếu BSA.
Như vậy, dung dịch 11 không chứa hóa chất ổn định nào, còn dung dịch 10 chỉ có BSA là hóa chất ổn định protein thông dụng.
Thí nghiệm được tiến hành như sau :
KTĐD 1C10 được bảo quản trong 11 ống chứa các dung dịch như trên. Ở các thời điểm 0 ngày, 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày, 150 ngày, tiến hành nhuộm miễn dịch tế bào HeLa và MCF-7 với 11 ống dung dịch kháng thể nêu trên.
Tín hiệu dương tính với protein p16INK4A là tín hiệu màu nâu trong nhân và tế bào
87
Hình 72. Kết quả nhuộm miễn dịch với KTĐD 1C10 tế bào HeLa và tế bào MCF-7 (chứng âm) trong các dung dịch bảo quản (1 – 11) và ở các mốc thời gian từ 0 đến 150 ngày
Kết quả (hình 72) cho thấy dung dịch 6, 7, 8, 9 cho tín hiệu nhuộm miễn dịch không mạnh. Lý do có thể là do dung dịch 6 (sucrose nồng độ cao nhất) và 7, 8, 9 là các dung dịch glycerol đều có độ nhớt cao khiến sự tiếp xúc giữa tế bào và hóa chất nhuộm miễn dịch không tốt. Còn các dung dịch 10, 11 đều không bổ sung thêm chất bảo quản. Các dung dịch 1,2,3,4,5, 10, 11 cho tín hiệu dương tính mạnh hơn.
Tín hiệu dương tính ở tất cả các dung dịch bảo quản đều mất hẳn ở 150 ngày. Trong đó, tín hiệu dương tính được duy trì lâu nhất (đến 120 ngày) khi kháng thể được bảo quản trong dung dịch 1,2. Các dung dịch bảo quản 10, 11 không cho tín hiệu dương tính từ ngày 60.
Như vậy, dung dịch 1, 2 có thể được sử dụng làm dung dịch bảo quản kháng thể vì không ảnh hưởng đáng kể đến phản ứng kháng nguyên kháng thể, và duy trì được hoạt tính sinh học của kháng thể đến 5 tháng. Chúng tôi chọn dung dịch 1 làm dung dịch bảo quản kháng thể với thời gian bảo quản không quá 120 ngày.