và MCF-7 với các nồng độ kháng thể 80 µg/ml, 40 µg/ml, 20 µg/ml và 10 µg/ml
4.6.4. CÁC ĐIỀU KIỆN BỘC LỘ KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH TRÊN LAME KÍNH
Bộc lộ kháng nguyên là một bước quan trọng giúp khôi phục lại các epitope đã bị thay đổi trong giai đoạn cố định bằng PFA, ethanol hay methanol. Trước tiên, chúng tôi khảo sátba tác nhân là citrate 10 mM pH 6, citrate 10 mM - EDTA 1 mM pH 6 và Tris 10 mM – EDTA 1 mM pH 9.
Hình 65. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào HeLa và C-33 A với kháng thể 1D5 (10 µg/ml), tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate 10 mM/EDTA 1 mM pH 6,Tris 10 mM/
82
Kết quả cho thấy KTĐD 1D5 và 1C10 hoạt động tốt nhất với dung dịch Tris- EDTA pH 9 (hình 65 và 67). KTĐD 2C1 hoạt động tốt ở cả hai dung dịch citrate-EDTA pH6 và Tris-EDTA pH 9 (hình 66). Vì vậy để tiện sử dụng, chúng tôi chọn dung dịch Tris-EDTA pH 9 làm dung dịch bộc lộ kháng nguyên cho quy trình.
Hình 66. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào CaSki và C-33 A với kháng thể 2C1 (20 µg/ml), sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate 10 mM/EDTA 1 mM pH 6,Tris 10
mM/ EDTA 1mM pH 9 và citrate 10 mM pH 6
Hình 67. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào HeLa và MCF-7 với kháng thể 1C10 (80 µg/ml), sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate 10 mM/EDTA 1 mM pH 6,Tris 10
mM/ EDTA 1mM pH 9 và citrate 10 mM pH 6
Tiếp theo, chúng tôi khảo sát thời gian và phương thức bộc lộ kháng nguyên : sử
dụng bể ổn nhiệt 950C hoặc lò vi sóng. Đối tượng khảo sát là KTĐD 1C10 trên tế bào
HeLa. Kết quả cho thấy (hình 68), bộc lộ kháng nguyên với tác nhân là Tris-EDTA pH 9 trong bể ổn nhiệt 20 phút và bằng lò vi sóng 10 phút có hiệu quả tương đương nhau. Như vậy, tùy theo tình hình thực tiễn có thể sử dụng một trong hai phương pháp để bộc lộ kháng nguyên.
83
Hình 68. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào HeLa với kháng thể 1C10 (80 µg/ml), sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là Tris 10 mM/ EDTA 1mM pH 9 theo 2 phương pháp
là đun trong bể ổn nhiệt và microwave, ở 2 thời gian xử lý là 10 phút và 20 phút
Như vậy, các thông số tối ưu cho quy trình hóa miễn dịch tế bào là : tác nhân cố định tế bào PFA 1 %, nồng độ KTĐD là 10µg/ml cho 1D5, 20 µg/ml cho 2C1 và 80 µg/ml cho 1C10, dung dịch Tris-EDTA pH 9 trong bể ổn nhiệt 20 phút hoặc lò vi sóng 10 phút để bộc lộ kháng nguyên.