Trước tiên, chúng tôi khảo sát nồng độ tối ưu của các KTĐD 1D5 phát hiện protein
E7 HPV 18, 2C1 phát hiện protein E7 HPV 16 và 1C10 phát hiện protein p16INK4A ở các
dòng tế bào nuôi cấy chủ động trên lamelle. Các kết quả này sẽ là cơ sở để để xây dựng quy trình nhuộm hóa tế bào miễn dịch với tế bào cổ tử cung cố định trên lame kính.
Với KTĐD 1D5, chúng tôi sử dụng tế bào HeLa, là dòng tế bào biểu hiện tự nhiên protein E7 HPV 18, để xác định nồng độ kháng thể tối ưu cho quy trình. Chúng tôi khảo sát ba nồng độ kháng thể là 2,5 µg/ml, 5 µg/ml và 10 µg/ml. Dòng tế bào C-33 A, là dòng
tế bào UTCTC nhưng không biểu hiện protein E7, được sử dụng làm tế bào chứng âm.
Thu tế bào qua ly tâm, trải và cố định tế bào lên lam kính Thu mẫu tế bào cổ tử cung và giữ trong dung dịch bảo quản
Bộc lộ kháng nguyên
Khóa peroxidase nội sinh
Lai với kháng thể sơ cấp
Lai với kháng thể thứ cấp
Phát hiện bằng cơ chất, nhuộm tương phản, quan sát kết quả
Khảo sát tác nhân cố định tế bào trên lam kính
Khảo sát tác nhân bộc lộ kháng nguyên
Khảo sát nồng độ kháng thể sơ cấp
76
Hình 55. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD kháng E7 HPV 18 - 1D5 trên dòng tế bào HeLa và C-33 A với các nồng độ kháng thể 10 µg/ml, 5 µg/ml và 2,5 µg/ml
Kết quả (hình 55) cho thấy tín hiệu dương tính quan sát được rõ nhất ở nồng độ 10 µg/ml trên tế bào HeLa ; tế bào C-33 A cho tín hiệu nền yếu ở cả ba nồng độ KTĐD khảo sát. Chúng tôi chọn nồng độ 10 µg/ml là nồng độ sử dụng cho kháng thể 1D5.
Hình 56. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD kháng E7 HPV 16 – 2C1 trên dòng tế bào CaSki và C-33 A với các nồng độ kháng thể 20 µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml và 2,5 µg/ml
77
Hình 57. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD kháng p16INK4A – 1C10 trên dòng tế
bào HeLa và MCF-7 với các nồng độ kháng thể 20 µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml và 2,5 µg/ml
Tương tự, với KTĐD 2C1, chúng tôi sử dụng tế bào CaSki là dòng tế bào biểu hiện tự nhiên protein E7 HPV 16 và dòng tế bào C-33 A là chứng âm. Với KTĐD 1C10,
chúng tôi sử dụng tế bào HeLa là dòng tế bào biểu hiện tự nhiên protein p16INK4A và dòng
tế bào MCF-7 là chứng âm. Chúng tôi khảo sát 3 nồng độ kháng thể là 2,5 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml và 20 µg/ml đối với cả 2 kháng thể. Kết quả với KTĐD 2C1 (hình 56) cho thấy tín hiệu dương tính rõ trên CaSki và không có tín hiệu nền trên C-33 A là ở nồng độ 5 µg/ml. Trong khi đó, KTĐD 1C10 cho kết quả nồng độ tối ưu ở 10 µg/ml (hình 57).
Chúng tôi nhuộm hóa tế bào miễn dịch với nhiều nồng độ kháng thể trên nhiều dòng tế bào như HeLa, CaSki, C-33 A, MCF-7, CHO-K1 chuyển gene E7 HPV 18 và CHO-K1 không chuyển gene để kiểm tra tính đặc hiệu của các KTĐD ở nồng độ sử dụng.
Hình 58. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch với KTĐD 1D5 (10 µg/ml) trên tế bào HeLa, C-33 A, CHO-K1 chuyển vector pEGFP-E7HPV18, CHO-K1 chuyển vector pEGFP-C2, CaSki
78
KTĐD 1D5 (10 µg/ml) cho tín hiệu dương tính với tế bào HeLa là CHO-K1 chuyển gene E7 HPV18, có tín hiệu rất mờ ở dòng tế bào CaSki và C-33 A (hình 58). KTĐD 2C1 (5 µg/ml) chỉ cho tín hiệu dương tính với CaSki mà không có tín hiệu nền với các dòng tế bào không biểu hiện E7 HPV 16 khác (hình 59). KTĐD 1C10 (10 µg/ml) cho
tín hiệu dương tính rõ trên các dòng tế bào có biểu hiện p16INK4A gồm HeLa, CaSki và C-
33 A, không có tín hiệu nền trên dòng chứng âm MCF-7 (hình 60).
Hình 59. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 2C1 (5 µg/ml) trên các dòng tế bào HeLa, Caski, C-33 A, MCF-7
Hình 60. Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 1C10 (10 µg/ml) trên các dòng tế bào HeLa, Caski, C-33 A, MCF-7
79
Như vậy, ở các nồng độ sử dụng, KTĐD 1D5 (10 µg/ml), 2C1 (5 µg/ml) và KTĐD 1C10 (10 µg/ml) cho tín hiệu dương tính đặc hiệu với các dòng tế bào chuyển gene và tế bào biểu hiện tự nhiên protein mục tiêu.
Sau khi xác định điều kiện lai hóa tế bào miễn dịch trên lamelle làm cơ sở cho nội dung tiếp theo, chúng tôi tiếp tục khảo sát các điều kiện thực nghiệm cho quy trình lai hóa tế bào miễn dịch với tế bào nuôi cấy và cố định trên lame kính nhằm áp dụng vào bệnh phẩm là tế bào cổ tử cung
Các điều kiện khảo sát bao gồm : tác nhân cố định tế bào, nồng độ KTĐD, công đoạn bộc lộ kháng nguyên (tác nhân, thời gian, phương thức). Cuối cùng, chúng tôi khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp lai hóa tế bào miễn dịch với các KTĐD trong những điều kiện đã xác định.