Dung hợp tạo tếbào lai (hybridoma)

 Chuẩn bị dòng tế bào u tủy (myeloma) cho dung hợp

Giải đông và nuôi cấy tế bào P3X63Ag8.653 trên môi trường RPM1640 trong bình Roux. Lô tế bào u tủy có tỉ lệ tế bào sống hơn 95 % được chọn để dung hợp.

Tỷ lệ tế bào sống được xác định bằng thử nghiệm Trypan blue.  Xác định tỉ lệ tế bào u tủy sống bằng phương pháp Trypan blue

Loại bỏ môi trường nuôi cấy trong bình Roux, rửa tế bào với 2 ml PBS 1X (-), bổ sung 2 ml Trypsin/EDTA vào bình nuôi, giữ trong 1 phút để tách tế bào. Huyền phù tế bào trong 1 ml môi trường, giữ dịch huyền phù trong eppendorf vô trùng. Hòa 15 µl dịch huyền phù tế bào vào 15 µl dung dịch Trypan blue, cho vào buồng đếm. Đếm số tế bào sống/ chết (tế bào chết bắt màu xanh).

 Thu nhận tế bào lách chuột :

Thu lách chuột vào đĩa Petri chứa môi trường RPMI 1640 không có huyết thanh.

Nghiền lách để thu tế bào, để yên ở 4C – 5 phút. Lọc qua lọc 70 m. Ly tâm dịch lọc

1200g – 10 phút. Thu cặn, hòa trong dung dịch NH4Cl 0,17 M lạnh, ủ 4C, 5-10 phút.

Thêm 50 ml PBS, ly tâm 1200g – 10 phút. Thu cặn, hòa trong 50 ml môi trường RPMI 1640 lạnh. Đếm số tế bào thu được, pha loãng bằng môi trường RPMI 1640 đến mật độ tế bào mong muốn.

 Dung hợp tế bào u tủy P3X63Ag8 với tế bào B từ lách chuột theo quy trình của Kohler và Misltein (1975).

23

Tế bào u tủy và tế bào lách được trộn chung với tỉ lệ 1:5 trong ống falcon 50 ml. Ly tâm 200 g - 7 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi và huyền phù cặn tế bào.Bổ sung 1

ml PEG 1500 đã ủ ấm ở 37oC bằng cách nhỏ từng giọt. Đặt ống falcon trong bể ổn nhiệt ở

37oC - 1 phút 30 giây. Thêm 20 ml PBS bằng cách nhỏ từng giọt.Sau 5 phút, tiến hành ly

tâm 1000 g - 5 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch nổi. Hòa cặn tế bào nhẹ nhàng trong môi trường RPMI 1640 20% FBS. Ly tâm 1000 g - 10 phút. Huyền phù cặn tế bào trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung HAT. Cho 100 µl dịch tế bào vào đĩa 96 giếng. Ủ

trong tủ ấm 37oC có bổ sung 5 % CO2.

Một tuần sau, bổ sung vào mỗi giếng trong đĩa 96 giếng 100 µl môi trường RPMI 1640 bổ sung HAT. Chọn lọc các dòng tế bào hybridoma phát triển được trên môi trường và khảo sát khả năng tạo KTĐD mục tiêu bằng phương pháp ELISA.

 Phân lập dòng hybridoma sản xuất kháng thể mục tiêu bằng pha loãng tới hạn

Tế bào trong các giếng cho tín hiệu dương tính với thử nghiệm ELISA được cấy chuyền và tiếp tục nuôi cấy trong đĩa 48 giếng, rồi đĩa 24 giếng và đĩa 6 giếng.Thu nhận và pha loãng tế bào trong môi trường RPMI 1640 để đạt mật độ 10 và 1 tế bào/giếng trên đĩa 96 giếng. Khi tế bào đạt độ phủ 70-80 % giếng, tiến hành kiểm tra lại khả năng sản

xuất KTĐD mục tiêu bằng thử nghiệm ELISA. Lặp lại quá trình trên thêm 1 lần nữa.

 Bảo quản dòng hybridoma

Tế bào hybridoma sản xuất KTĐD ổn định từ đĩa 96 giếng được lần lượt chuyển

sang nuôi cấy trong đĩa 48, 12 giếng và bình Roux 25 cm2. Dịch nuôi cấy có mật độ

5x106 tế bào được ly tâm 1200 g - 10 phút. Cặn tế bào được huyền phù nhẹ trong 1 ml

huyết thanh bào thai bò (FBS) có bổ sung 10 % DMSO. Chuyển 1 ml dịch huyền phù vào

ống bảo quản. Bảo quản tế bào ở -80oC, 1 ngày sau chuyển vào nitơ lỏng.