4.9.3.1. Độ đúng
Do không có “chuẩn vàng” để xác nhận sự hiện diện của protein p16INK4A trong
mẫu thử, độ đúng của kit KTp16ICC được xác định bằng cách so sánh với kết quả làm song song từ kit CINtec (mtm). Kit này được chọn vì nhiều lý do : (1) đây là kit có chứng
nhận “CE IVD” (chuẩn châu Âu cho chẩn đoán in vitro), (2) nhiều công trình công bố cho
thấy hiệu quả hoạt động cao của kit này. Cụ thể như các công bố của Giovanni và cộng sự tiến hành trên 45 mẫu ung thư, của Wentzensen và cộng sự (2006) trên 137 ASCUS và 88 LSIL, của Meyer và cộng sự (2007) trên 163 mẫu tế bào bất thường có theo dõi tiến triển (follow-up) trong 6 tháng, của 118 mẫu tế bào có kết quả soi cổ tử cung và theo dõi, của Reuschenbach và cộng sự (2010) trên 275 mẫu thu nhận trong dung dịch ThinPrep, của Denton và cộng sự (2010) trên 810 mẫu hồi cứu có kết quả theo dõi, của Jordan và cộng sự (2012) trên 240 mẫu đúc paraffin. Tất cả các công trình vừa nêu đều cho thấy giá trị
của “chỉ thị sinh học” p16INK4Atrong việc nhận diện các trường hợp có khả năng diễn tiến
thành ung thư trong số các ca ASCUS hay LSIL và làm tăng tính thống nhất trong chẩn đoán tế bào học so với nhuộm H&E đơn thuần.
Vì xét nghiệm p16INK4A thuộc nhóm I, nghĩa là không thể được cung cấp như kết
114
nhuộm miễn dịch p16INK4A chỉ được xem là (+) và có ý nghĩa lâm sàng khi đi kèm với các
đặc điểm tế bào học, cụ thể là : (1) kích thước nhân tế bào lớn hơn nhân tế bào bình thường-trung gian hoặc tế bào đáy, tỉ lệ nhân/tế bào chất tăng chiếm trên 50 % thể tích tế bào, (2) nhiễm sắc chất phân bố không đều có nhiểu hạt, bắt màu đậm hơn, (3) hình dạng nhân bất thường và rìa nhân không đều đặn, (4) tế bào đáy có hình dạng, kích thước và cấu trúc đa dạng (Wentzensen & cs, 2005). Đặc biệt trong các công trình đã công bố, kết quả cần được đánh giá từ nhiều chuyên gia để lấy kết luận thống nhất (Bergeron & cs, 2010 ; Denton & cs, 2010).
Trong đề tài này chúng tôi chưa có điều kiện triển khai điều này nên các kết quả (+) là những kết quả nhuộm (+) nhưng không nhất thiết liên quan đến bất thường tế bào.
Thử nghiệm so sánh được tiến hành thành hai đợt : đợt I trên nhóm mẫu chủ yếu là mẫu ung thư thu nhận từ BV Ung Bướu Tp HCM, và đợt II trên nhóm mẫu thu nhận từ những người đi khám phụ khoa ở BV Hùng Vương Tp HCM.
Đợt I được tiến hành tại BM Di truyền – trường ĐHKHTN. Số lượng mẫu sử dụng cho thử nghiệm là 94 mẫu tế bảo cổ tử cung thu để làm Pap test và bảo quản trong dịch bảo quản tế bào, trong đó có 69 mẫu được chẩn đoán là ung thư và 15 mẫu có chẩn đoán lâm sàng từ viêm cổ tử cung nhẹ đến nặng.
Bảng 25. Kết quả nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC và CINtec đợt I CINtec
(+) (-)
KTp16ICC
(+) 70 2
(-) 12 10
Kết quả (bảng 25, phụ lục 53, 54) cho thấy :
Phù hợp : 70 mẫu (+) và 10 mẫu (-) thuộc cả nhóm ung thư và nhóm có chẩn đoán lâm
sàng khác. Trong các trường hợp (+) với cả hai kit, tín hiệu nhuộm miễn dịch có cường độ không khác biệt lớn (hình 87, phụ lục 51, 52).
Không phù hợp : 14 mẫu, trong đó :
- 12 mẫu kit CINtec cho kết quả (+) còn kit KTp16ICC cho kết quả (-), trong đó 9 mẫu thuộc nhóm ung thư và 3 mẫu ở nhóm viêm ; 11 mẫu/12 mẫu có HPV định týp (+). Như
vậy, các trường hợp kit KTp16ICC không phát hiện được p16INK4A có thể là do lỗi kỹ
115
- 2 mẫu kit KTp16ICC cho kết quả (+) còn kit CINtec cho kết quả (-) đều thuộc nhóm viêm và đều có kết quả phân týp HPV (+). Nguyên nhân có thể tương tự như trên.
Trong đợt thử nghiệm I, kit KTp16ICC có mức độ phù hợp với kit CINtec là 85 %
Hình 86. Tế bào cổ tử cung nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC (A) và kit CINtec (B)
Đợt II được tiến hành tại BV Hùng Vương, trên 35 mẫu.
Bảng 26. Kết quả nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC và kit CINtec đợt II CINtech
(+) (-)
KTp16ICC
(+) 23 3
(-) 2 7
Kết quả (bảng 26, phụ lục 51, 52) cho thấy :
Phù hợp : 30 mẫu, trong đó có 23 mẫu (+) và 7 mẫu (-)
Không phù hợp : là 5 mẫu, trong đó, kit CINtec phát hiện 2 mẫu (+) và kit KTp16ICC
phát hiện 3 mẫu (+). Trong số này, 2 mẫu (+) với kit CINtec là mẫu LSIL, còn 3 mẫu (+) với kit KTp16ICC.
Trong đợt thử nghiệm II, kit KTp16ICC cho kết quả phù hợp với kit CINtec với tỉ lệ là 85,7 %.
Nhìn chung, độ đúng của kit KTp16ICC so với kit CINtec là tốt 4.9.3.2. Độ chính xác
Để khảo sát độ chính xác của kit KTp16ICC, chúng tôi tiến hành hai loạt thí nghiệm.
Loạt I nhằm xác định độ lặp lại nội phản ứng được tiến hành tại PTN công ty Khoa
Thương. Mẫu sử dụng là tế bào HeLabiểu hiện protein p16INK4A và tế bào MCF-7 không
biểu hiện protein này, với mật độ là 106 tế bào/ml. Trong loạt thí nghiệm này, kết quả
được xác định dựa trên quan sát dưới kính hiển vi về sự hiện diện của tế bào nhuộm màu
B A
116
nâu, đồng thời cường độ nhuộm miễn dịch cũng được đánh giá một cách chủ quan là cao +++, trung bình ++ và thấp +.
Hình 87. Tế bào HeLa (A) và MCF-7 (B) nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC với các lần lặp lại (1), (2) (3).
Kết quả (hình 88) cho thấy ở ba lần lặp lại, tế bào HeLa nhuộm dương tính với cường độ cao +++, còn tế bào MCF-7 cho kết quả âm tính.
Loạt thí nghiệm II nhằm xác định độ lặp lại liên phản ứng được tiến hành tại bốn địa điểm : BV Hùng Vương, BV Thủ Đức, BV Bình Dương và PTN công ty Khoa Thương. Mẫu sử dụng tương tự như trên. Kết quả cũng được xác định dựa trên quan sát dưới kính hiển vi về sự hiện diện của tế bào nhuộm màu nâu, đồng thời cường độ nhuộm miễn dịch cũng được đánh giá một cách chủ quan là cao +++, trung bình ++ và thấp +.
117
Hình 88. Tế bào HeLa (A) và MCF-7 (B) nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC ở các đơn vị : BV Bình Dương (1), BV Thủ Đức (2), Khoa Thương (3), BV Hùng Vương (4)
Kết quả (hình 89) cho thấy ở bốn lần lặp lại, về mặt định tính thì tất cả các mẫu thử ở cả bốn đơn vị đều cho kết quả nhuộm dương tính với tế bào HeLa và âm tính với tế bào MCF-7. Tuy nhiên, cường độ nhuộm lại biến đổi, Và màu nhuộm tương phản hematoxylin cho tín hiệu không đồng đều. ở BV tín hiệu dương tính yếu hơn so với PTN của công ty Khoa Thương. Chúng tôi nhận thấy trong quy trình HTBMD tiến hành ở bốn nơi này, bước “bộc lộ kháng nguyên” là bước khác biệt duy nhất ; trong đó tác nhân nhiệt có thể được cung cấp qua bể ủ ổn nhiệt, đun cách thủy trên bếp điện hoặc dùng lò vi ba. Điều này phù hợp với những công bố trước đây về vai trò của bước “bộc lộ kháng nguyên” trong quy trình hóa tế bào/mô miễn dịch (McNicol & Richmond, 1998). Kết quả tốt nhất trong thử nghiệm của chúng tôi đạt được là khi sử dụng bể ổn nhiệt.
118
4.9.3.3. Độ đặc hiệu phân tích
Để xác định độ đặc hiệu phân tích của kit KTp16ICC, chúng tôi sử dụng tế bào
CHO-K1 chuyển gene mã hóa protein p16INK4A và tế bào HeLa biểu hiện tự nhiên protein
E7 HPV 18.
Tính đặc hiệu của KTĐD p16INK4A trên tế bào CHO-K1 tái tổ hợp
Ở bước sóng kích thích 541 nm, chỉ có tế bào CHO-K1 mang genemã hóa cho
protein p16INK4A là tương tác với KTĐD 1C10 (hình 90 A3) và kháng thể thương mại
(hình 90 E3) và phát huỳnh quang màu đỏ/cam. Trong khi đó, tín hiệu dương tính không xuất hiện khi lai KTĐD 1C10 và kháng thể thương mại vớitế bào CHO-K1 EGFP-C2 (hình 90 B3, D3). Điều này cho thấy KTĐD 1C10 tương tác đặc hiệu với protein p16INK4Abiểu hiện trong tế bào động vậthữu nhũ chuyển gene.
Hình 89. Kết quả miễn dịch huỳnh quang trên tế bào CHO-K1 EGFP-p16INK4A và CHO-K1
pEGFP-C2 bằng KTĐD 1C10 (20X). A1, B1: tế bào CHO-K1pEGFP-p16INK4A và CHO-K1
pEGFP-C2 nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst. A2, B2: tín hiệu huỳnh quang GFP ở 488 nm. A3,
B3: tín hiệu lai với KTĐD 1C10 kháng protein p16INK4A ở 541nm. A4, B4: hình kết hợp. C1, D1:
tế bào CHO-K1 pEGFP-p16INK4A và CHO-K1 pEGFP-C2 nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst. C2,
D2: tín hiệu huỳnh quang GFP ở 488 nm. C3, D3: tín hiệu lai với KTĐD kháng protein p16INK4A
thương mại (Santa Cruz) ở 541 nm. C4, D4: hình kết hợp.
Tính đặc hiệu của KTĐD 1C10 trên dòng tế bào HeLa
Chúng tôi tiếp tục khảo sát tính đặc hiệu của KTĐD 1C10 trên tế bào HeLa biểu hiện tự nhiên protein E7 HPV 18 ; tế bảo MCF-7 không biểu hiện E7 được dùng làm chứng âm. Tế bào MCF-7không cho tín hiệu dương tínhvới cả KTĐD 1C10và kháng thể
119
thương mại (hình 91 B2, D2).Trong khi đó, KTĐD 1C10 (hình 91 A2) và kháng thể thương mại (hình 91 E2) đều cho tín hiệu huỳnh quang đỏ/cam trên tế bào HeLa, tín hiệu này chồng lắp một phần với tín hiệu huỳnh quang màu xanh của Hoechst (hình 91 A3 và
C3). Kết quả này cho thấy KTĐD 1C10 tương tác đặc hiệu với protein p16INK4A biểu hiện
trong nhân và tế bào chất của tế bào HeLa. Điều này phù hợp với kết quả nhiều công trình đã công bố (Sawicka& cs, 2013).
Hình 90. Kết quả lai miễn dịch huỳnh quang trên tế bào HeLa và MCF7 với KTĐD 1C10 (20X). A1,B1: tế bào HeLa, MCF7 nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst. A2, B2: tín hiệu với KTĐD1C10 ở 541 nm. A3, B3: hình kết hợp. C1, D1: tếbào HeLa, MCF7 nhuộm với thuốc
nhuộm Hoechst. C2, D2: tín hiệu với KTĐD kháng p16INK4A thương mại ở 541 nm. C3, D3: hình
kết hợp.
Kết quả trên cho thấy KTĐD 1C10 tương tác đặc hiệu với kháng nguyên nghiên cứu, biểu hiện nhân tạo hay tự nhiên trong các dòng tế bào khảo sát, và không cho phản ứng chéo với những tế bảo không biểu hiện protein này.