Chúng tôi sử dụng thông số đã xác định về nồng độ kháng thể “bắt giữ” là 2,5
µg/ml đối với 1C10, 3,3 µg/ml đối với JC8 và nồng độ kháng nguyên p16INK4A là 5 µg/ml
để tìm nồng độ kháng thể “cộng hợp HRP” tối ưu.Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, độ pha loãng kháng thể “cộng hợp HRP”tối đa nên sử dụng là 1/1000 tương đương với 0,013 µg/ml.
A
91
Do vậy, dãy pha loãng kháng thể “cộng hợp HRP” được thiết lập là 1/1000 – 1/16000. Chúng tôi sử dụng dãy pha loãng này theo cột và thiết lập dãy pha loãng nồng độ kháng thể “phát hiện” theo hàng, để tìm nồng độ bão hòa của kháng thể “ cộng hợp HRP”. Như vậy, dãy nồng độ kháng thể “phát hiện” sử dụng là 0,1µg/ml, 0,21 µg/ml, 0,41 µg/ml, 0,83 µg/ml, 1,65 µg/ml, 3,3 µg/ml và 6,6 µg/ml.
Hình 76. Giá trịOD450 ở các nồng độ kháng thể “cộng hợp HRP” với kháng thể “bắt giữ” là
1C10 (A) và JC8 (B)
Kết quả (hình 76, phụ lục 20) cho thấy hai độ pha loãng nồng độ kháng thể “cộng
hợp HRP” là 1/1000 và 1/2000 đều cho giá trị OD450 tương đương nhau ở cả hai thử
nghiệm ELISA sử dụng kháng thể “bắt giữ” là 1C10 và JC8. Trong khi ở các độ pha loãng thấp hơn, tín hiệu giảm đáng kể ở cả hai thử nghiệm. Bên cạnh đó, tín hiệu nền khi không bổ sung kháng nguyên ở độ pha loãng 1/2000 thấp hơn ở 1/1000. Như vậy độ pha loãng nồng độ kháng thể “cộng hợp HRP” tối ưu là 1/2000. Chúng tôi sử dụng độ pha loãng này để thực hiện tiếp các thử nghiệm sau.