Kit được đặt tên là kit KTImmunoPCR E7/18, nhằm phát hiện protein E7 HPV 18 trong dịch ly giải tế bào cổ tử cung.
4.8.1. ĐỘ ĐÚNG :
Trong đề tài này, do không có “chuẩn vàng”, độ đúng của kit KTImmunoPCR E7/18 được xác định thông qua việc so sánh với kết quả PCR định týp thu nhận bằng kit Amplisense HPV Typing (Nuclear Laser Medicine). Kit này phát hiện 12 týp HPV “nguy cơ cao” phổ biến theo khuyến cáo của ASCCP (American Society for Colposcopy and Cervical Pathology). Kit này được sử dụng dựa trên một số công bố so sánh kit với một số kit khác trong đó có INNOLiPA (Innogenetics – Bỉ) cho thấy mức độ thống nhất cao giữa các kit này trong việc định týp HPV trên mẫu nhiễm đơn (Gillio-Tos và cs, 2006 ; Else và cs, 2010 ; European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening).
Ngoài ra, kit này có chứng nhận “CE IVD” (đạt tiêu chuẩn châu Âu cho chẩn đoán in
vitro).
Thí nghiệm được tiến hành tại Trung tâm Quatest 3 trên những mẫu dịch tế bào cổ tử cung đã được định týp bằng kit Amplisense HPV Typing ở PTN công ty Khoa Thương. Kết quả (bảng 18, phụ lục 22) cho thấy chỉ có 4 mẫu phù hợp trên 28 mẫu thử,
96
với tỉ lệ phù hợp là 14,3 %. Thử nghiệm không cho kết quả âm tính nào, chỉ có cường độ tín hiệu dương tính biến đổi từ (+) đến (+++).
Như vậy, độ đúng của kit KTImmunoPCR E7/18, so sánh với kết quả phân týp
HPV là rất thấp.
Bảng 18. Tổng kết kết quả immunoPCR E7/HPV 18 dựa trên kết quả định týp HPV
Týp HPV ImmunoPCR E7/18 HPV týp 18 HPV týp khác (-) (+) 4 (2+++, 2+) 7 (+++) 17 (14 ++/+++ ; 3 +) (-) 0 0 0 4.8.2. ĐỘ CHÍNH XÁC
Để khảo sát độ chính xác của kit KTImmunoPCR E7/18, chúng tôi tiến hành hai loạt thí nghiệm. Loạt I nhằm xác định độ lặp lại nội phản ứng, loạt II nhằm xác định độ lặp lại liên phản ứng. Trong hai loạt thí nghiệm này, phương pháp sử dụng là immunoPCR real-time và giá trị Ct được dùng để tính toán độ chính xác.
Loạt thí nghiệm I nhằm xác định độ lặp lại nội phản ứng, được tiến hành tại PTN công ty Khoa Thương. Mẫu sử dụng là dịch tế bào HeLa và protein E7 HPV 18 pha loãng
nhiều bậc để tạo ra 05 hỗn hợp. Bậc pha loãng cao nhất đối với tế bào HeLa là 2,5.106tế
bào/ml và bậc pha loãng thấp nhất là 0 tế bào/ml. Đối với protein E7 HPV 18, nồng độ cao nhất là 10 µg/ml và thấp nhất là 0 ng/ml.
Hệ số biến thiên nội phản ứng được tính theo công thức là : CV nội phản ứng (n=12) = trung bình % CV = 2,96
Trong đó, CV= Độ lệch chuẩn/trung bình cộng giá trị tín hiệu các mẩu.
Với giá trị CV nội phản ứng < 10 được xem là chấp nhận được (www.salimetrics.com) thì kết quả chúng tôi nhận được (bảng 19, phụ lục 23) cho thấy thử nghiệm có độ lặp lại nội phản ứng tốt. Tuy nhiên, giá trị Ct giữa các mật độ tế bào khác nhau không có sự khác biệt đáng kể.
97
Bảng 19. Độ lặp lại nội phản ứng của kit immunoPCR E7/18 trên dich tế bào HeLa và protein E7 HPV 18 tái tổ hợp Mật độ tế bào/nồng độ protein E7 HPV 18 Giá trị Ct lần 1 Giá trị Ct lần 2 Trung bình Độ lệch chuẩn (SD - standard deviation) % hệ số biến thiên (CV – coefficient of variation) Dịch tế bào HeLa 2,5x106 tế bào/ml 29,89 27,59 28,74 1,626 5,66 2,5x105 tế bào/ml 30,58 31,37 30,98 0,559 1,80 2,5x104 tế bào/ml 33,34 34,56 33,95 0,863 2,54 2,5x103 tế bào/ml 34,56 33,78 34,17 0,552 1,61 2,5x102 tế bào/ml 34,38 35,23 34,81 0,601 1,73 0 tế bào/ml 34,33 35,66 35,00 0,940 2,69 Protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 10 µg/ml 23,96 25,66 24,81 1,202 4,85 1 µg/ml 30,72 29,17 29,95 1,096 3,66 100 ng/ml 30,33 33,73 32,03 2,404 7,51 10 ng/ml 34,89 35,46 35,18 0,403 1,15 0 µg/ml 35,79 35,55 35,67 0,170 0,48
Như vậy, độ lặp lại nội phản ứng của kit KTImmunoPCR E7/18 nằm trong khoảng chấp nhận được nhưng tương quan giữa kết quả imunoPCR với mức độ hiện diện của phân tử mục tiêu trong mẫu là thấp.
Loạt thí nghiệm II nhằm xác định độ lặp lại liên phản ứng được tiến hành tại hai địa điểm : Trung tâm Đào tạo và Chẩn đoán Y Sinh phân tử - ĐH Y Dược Tp HCM và PTN Sinh học Phân tử - Bộ môn Di truyền – Trường ĐHKHTN. Mẫu sử dụng tương tự như trên.
Kết quả (bảng 20, phụ lục 24) cho thấy sự biến thiên liên phản ứng của kit KTImmunoPCR E7/18. Độ lặp lại liên phản ứng được tính toán dựa trên trung bình cộng của % CV giữa hai phòng thí nghiệm. Như vậy, CV giữa hai phòng thí nghiệm trong đề tài của chúng tôi là 3,16 %, nằm trong ngưỡng công bố (% CV < 10 %).
98
Bảng 20. Độ lặp lại liên phản ứng của kit KTE7-18 immunoPCR trên dich tế bào HeLa và protein E7 HPV 18 tái tổ hợp
Mẫu Trung tâm Y Sinh học phân tử Công ty Khoa Thương Ct lần 1 Ct lần 2 Ct lần 1 Ct lần 2 Dịch tế bào HeLa 2,5x106 tế bào/ml 29,99 27,39 29,89 27,59 2,5x105 tế bào/ml 31,58 29,37 30,58 31,37 2,5x104 tế bào/ml 32,34 33,66 33,34 34,56 2,5x103 tế bào/ml 33,76 35,65 34,56 33,78 2,5x102 tế bào/ml 33,28 34,53 34,38 35,23 0 tế bào/ml 34,69 35,78 34,33 35,66 Protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 10 µg/ml 25,56 26,96 23,96 25,66 1 µg/ml 30,68 31,5 30,72 29,17 100 ng/ml 32,4 33,35 30,33 33,73 10 ng/ml 34,24 33,84 34,89 35,46 0 µg/ml 34,25 34,56 35,79 35,55 4.8.3. ĐỘ ĐẶC HIỆU PHÂN TÍCH
Trong đề tài này, độ đặc hiệu phân tích của kit KTImmunoPCR E7/18 được xác định bằng cách sử dụng các dòng tế bào HeLa có biểu hiện E7 HPV 18 và dòng C-33A
không biểu hiện protein này với hai mật độ tế bào cao và thấp lần lượt là 2,5 x 106 tế
bào/ml và 2,5 x 104 tế bào/ml (Torlakovic & cs, 2010). Phương pháp sử dụng là
immunoPCR real-time với giá trị khảo sát là giá trị Ct. Địa điểm tiến hành là PTN công ty Khoa Thương.
Bảng 21. Kết quả ImmunoPCR E7/18 trên dịch tế bào HeLa và MCF-7
Mật độ tế bào Giá trị Ct
HeLa 2,5 x 106tế bào/ml 28,76 ± 0,495 2,5 x 104tế bào/ml 34,26 ± 0,665 C33-A 3,0 x 106tế bào/ml 33,21 ± 0,445 3,0 x 104tế bào/ml 34,28 ± 0,693
Kết quả (bảng 21, phụ lục 25) cho thấy không có sự khác biệt lớn về giá trị Ct đạt được trên tế bào HeLa và C-33A. Điều này có thể là do KTĐD 1D5 không hoàn toàn đặc hiệu cho kháng nguyên E7 HPV 18, có thể nhận biết cả một số phân tử nội bào khác trong dịch ly giải tế bào. Bên cạnh đó, sự chênh lệch không lớn giữa hai mật độ tế bào thấp và
99
cao có thể là do sự loại bỏ không triệt để amplicon tự do sau bước rửa và cả sự không thu hồi được toàn bộ amplicon đã được bắt giữ trước khi tiến hành phản ứng PCR. Như vậy, tín hiệu dương tính ở đây không phản ánh chính xác hàm lượng kháng nguyên mục tiêu.
4.8.4. ĐỘ NHẠY PHÂN TÍCH
Chúng tôi xác định độ nhạy phân tích của kit KTimmunoPCR E7/18 bằng kỹ thuật immunoPCR real-time. Nguyên liệu sử dụng cho nội dung này là kháng nguyên E7 HPV
18 pha loãng theo bậc 10 từ 10 g/ml đến 10 pg/ml.
Bảng 22. Giá trị Ct của các nồng độ protein tái tổ hợp E7 HPV 18 Nồng độ protein E7/ HPV 18 Lần 1 Lần 2 Trung bình STD 10µg/ml 26,66 25,66 26,16 0,707 1 µg/ml 29,67 29,29 29,48 0,269 100 ng/ml 30,33 31,32 30,93 0,841 10 ng/ml 32,84 31,86 32,35 0,693 1 ng/ml 33,25 33,89 33,57 0,453 100 pg/ml 33,96 34,65 34,31 0,488 10 pg/ml 34,60 35,15 34,88 0,389 0 pg/ml 34,96 35,55 35,26 0,417
Kết quả cho thấy kit KTimmunoPCR E7-18 có thể phát hiện kháng nguyên tái tổ hợp từ nồng độ 1 ng/ml. Ở các nồng độ thấp hơn, giá trị Ct ±STD không khác biệt so với mẫu âm (0 pg/ml).
4.8.5. KHẢ NĂNG TRIỂN KHAI ĐẠI TRÀ KIT TẠI CÁC CƠ SỞ Y TẾ
Trước tiên, cần nhắc lại lưu đồ khái quát của phương pháp immunoPCR :
Kit KTImmunoPCR E7/18 được thử nghiệm trên các mẫu tế bào cổ tử cung tại PTN SHPT – BM Di truyền và Trung tâm Quatest 3 cho thấy một số ưu nhược điểm sau đây. Dịch tế bào cổ tử cung ly giải ELISA phát hiện protein mục tiêu PCR phát hiện trình tự DNA
nhân tạo Điện di sản phẩm PCR (PCR cổ điển) Bổ sung trình tự DNA nhân tạo, mồi đánh dấu biotin Đọc kết quả trực tiếp (PCR real-time)
100
Ưu điểm :
- Độ lặp lại nội phản ứng và liên phản ứng tốt
Nhược điểm :
- Độ nhạy phân tích thấp so với một số công bố trước đây cho thấy có thể đạt đến giới hạn phát hiện là 40 – 100 pg/ml (Niemeyer & cs, 2005), nhạy hơn kit do chúng tôi phát triển 10 – 20 lần.
- Độ đặc hiệu phân tích thấp, có thể là do KTĐD 1D5 có thể nhận biết nhiều phân tử hiện diện trong dịch tế bào một cách không đặc hiệu.
- Kết quả không có mối tương quan cao với hàm lượng kháng nguyên hiện diện trong mẫu. Nguyên nhân có thể là do quy trình không có khả năng loại bỏ triệt để amplicon tự do, tuy đã sử dụng đến 25 lần rửa và cũng không thu hồi được toàn bộ amplicon được bắt giữ trên giếngđể chuyển sang phản ứng PCR.
- Thao tác phức tạp với nhiều bước do phải sử dụng liên tiếphai phương pháp ELISA và PCR.
- Nếu sử dụng immunoPCR real-time thì độ nhạy cao hơn và ít gây ngoại nhiễm hơn immunoPCR điện di nhưng lại cần thiết bị real-time PCR.
- Khả năng gây ngoại nhiễm cao do bước “Bổ sung trình tự DNA nhân tạo và mồi đánh dấu biotin” từ đĩa ELISA sau khi kết thúc phản ứng ELISA sang ống nghiệm PCR để tiến hành phản ứng PCR sau đó. Việc bổ sung có thể thực hiện theo hai cách : (1) nếu có thiết bị PCR hoạt động được với đĩa ELISA thì bổ sung các thành phần trên vào đĩa ELISA và sử dụng đĩa ELISA này cho phản ứng PCR ; (2) nếu không có thiết bị chuyên dụng, cần chuyển mẫu từ đĩa ELISA sang ống nghiệm PCR. Cách thứ nhất ít nguy cơ hơn cách thứ hai nhưng vẫn có khả năng gây ngoại nhiễm và đòi hỏi thiết bị và dụng cụ chuyên dụng nên khó triển khai rộng rãi. Trong đề tài này, do không có các thiết bị và dụng cụ chuyên dụng nên mọi thao tác đều làm bằng tay làm tăng cao nguy cơ ngoại nhiễm nếu sử dụng thường xuyên.
Những nhận xét này phù hợp với nhận định của Adler và cộng sự (2008), theo đó để có quy trình immunoPCR thành công cần có một số điều kiện như : (1) đĩa chuyên dụng vừa có khả năng bắt giữ protein cho phản ứng ELISA vừa có các đặc tính lý hóa học phù hợp với phản ứng PCR, (2) thiết bị chuyên dụng (ly tâm đĩa, PCR đĩa). Bên cạnh ưu điểm rất cao về độ nhạy và khả năng làm việc với những mẫu có thể tích rất nhỏ, các tác
101
giả này cũng nêu một số nhược điểm như : thao tác phức tạp, khả năng sai sót do số bước thao tác tăng so với ELISA cổ điển, cần biện pháp chống ngoại nhiễm.
Tóm lại, kit KTImmunoPCR E7/18 immunoPCR phát triển trong đề tài này không thể sử dụng để phát hiện hay định lượng kháng nguyên E7 HPV 18 trong mẫu bệnh.
4.9. KIT HÓA TẾ BÀO MIỄN DỊCH (HTBMD) - XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG ĐỘNG
Xét nghiệm hóa miễn dịch tế bào/mô được phân thành ba nhóm : nhóm I là các xét nghiệm cung cấp thông tin bổ sung cho các xét nghiệm tế bào học cổ điển (H&E) chứ không được trả như những kết quả độc lập và được sử dụng bởi các nhà bệnh học, ví dụ như các “chỉ thị” về biệt hóa tế bào (cytokeratin, vimentin) ; nhóm II là các xét nghiệm cho kết quả hoàn toàn độc lập và thường được công nhận trong các khuyến cáo chính thức (quốc gia hay quốc tế), ví dụ như thụ thể hormone trong ung thư vú ; nhóm III là những xét nghiệm không đáp ứng các tiêu chuẩn của hai nhóm trên hoặc khơi lên một số vấn đề về hiệu quả và an toàn, ví dụ như các “chỉ thị” liên quan đến một số đột biến di truyền được xem là có ý nghĩa lâm sàng nhưng không thể khẳng định bằng phương pháp tế bào học (CDRH-FDA, 1998).
Các kit HTBMD phát triển trong đề tài này thuộc nhóm I và được đặt tên là kit KTE7-16ICC (phát hiện E7 HPV16), kitKTE7-18ICC (phát hiện E7 HPV18),kit
KTp16ICC (phát hiện p16INK4A).
4.9.1. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA KIT KTE7-16ICC
4.9.1.1. Độ đúng
Do không có “chuẩn vàng” để xác nhận sự hiện diện của protein E7 HPV 16 trong mẫu thử, độ đúng của kit KTE7-16ICC được xác định gián tiếp thông qua kết quả định týp HPV với kit Amplisense HPV Typing.
Thử nghiệm định týp được tiến hành ở PTN công ty Khoa Thương còn thử nghiệm HTBMD E7 HPV 16 được tiến hành tại BV Hùng Vương. Số lượng mẫu sử dụng cho thử nghiệm là 50 mẫu tế bảo cổ tử cung bảo quản trong dịch ThinPrep.
Kết quả (bảng 23, phụ lục 48,51) cho thấy :
Kết quả phù hợp trên 40 mẫu (80 %), trong đó có 5 mẫu (+) và 35 mẫu (-).
Kết quả không phù hợp trên 10 mẫu (20 %), trong đó :
102
(2) HPV định týp khác / HTBMD (+) : 7 mẫu (3) HPV định týp (-) / HTBMD (+) : 2 mẫu
Bảng 23. Kết quả hóa miễn dịch tế bào E7 HPV 16 so với kết quả định týp HPV
Định týp HMDTB Týp HPV 16 Khác (-) E7 HPV 16 (+) 5 7 2 (-) 2 16 19 Nhận xét :
(1) HPV 16 (+) / HTBMD (-). Tuy không có dữ liệu về protein nhưng theo một công trình công bố gần đây (Andersson & cs, 2012), mRNA E6/E7 được phát hiện trong 88 % các trường hợp (+) DNA HPV, và biểu hiện E6/E7 tăng đáng kể ở các trường hợp CIN2+. Sử dụng kháng thể đặc hiệu E7 HPV 16 có thể phát hiện được 51,78 % trường hợp nhiễm HPV (Rosales & cs, 2001). Như vậy, kết quả chúng tôi nhận được cho 2 trường hợp này có thể rơi vào tỉ lệ âm tính của các công bố trên. Mặt khác, cả 2 trường hợp (2237, 5017) đều có xét nghiệm tế bào học là LSIL trong khi các công bố trước đây cho thấy E7 HPV 16 biểu hiện rất yếu ở các trường hợp bình thường và LSIL, nhưng biểu hiện mạnh ở các ca HSIL và mô ung thư (Fiedler & cs, 2004 ; Andersson & cs, 2012).
(2) HPV týp khác / HTBMD (+). Trong số 7 trường hợp trong thử nghiệm này có 1 týp HPV 33, 1 týp HPV 51, 3 týp HPV 52, 1 týp HPV 58, 1 týp HPV 59. Theo phân loại các týp HPV dựa trên mức độ tương đồng bộ gene thì nhóm virus này được phân thành 16 giống (genus), được đặt tên theo thứ tự lần lượt là Alpha-papillomavirus, Beta- papillomavirus, … cho đến Pi-papillomavirus ; mỗi giống lại bao gồm nhiều nhóm phụ. Trong đó, các týp 16, 31, 33, 35, 52, 58, 67 thuộc nhóm phụ 9,týp 51 thuộc nhóm phụ 5 và týp 59 thuộc nhóm phụ 7, đều là các nhóm phụ của giống Alpha-papillomavirus (de Villiers & cs, 2004). Ngoài ra, một công trình so sánh trình tự protein E7 giữa các týp HPV cho thấy trình tự E7 HPV 16 và các týp khác trong nhóm phụ 9 có độ tương đồng rất cao (Munger & Harpen, 1997). Như vậy, trong kết quả mà chúng tôi nhận được có 5 trường hợp nhiễm các týp cùng nhóm phụ với týp 16 và có khả năng là các týp này cho phản ứng chéo với KTĐD nhận biết E7 HPV 16. Hai trường hợp còn lại (51, 59) nằm ở hai nhóm phụ khác và có mức độ tương đồng thấp hơn nhưng đều thuộc cùng giống Alpha-papillomavirus.
103
(3) HPV định týp (-) / HTBMD (+). Có thể giả định là kết quả định týp HPV là âm tính giả hoặc kết quả HTBMD là dương tính giả. Một khả năng khác là mẫu nhiễm một týp HPV “nguy cơ cao” không nằm trong số 14 týp phổ biến. Do lượng mẫu bệnh giới hạn mà phải sử dụng cho nhiều thử nghiệm nên chúng tôi không lặp lại được thử nghiệm trên các mẫu nảy để có kết quả rõ ràng.
Nhìn chung, kit KTE7-16ICC cho kết quả khá phù hợp với kết quả định týp HPV. 4.9.1.2. Độ chính xác
Để khảo sát độ chính xác của kit KTE7-16ICC, chúng tôi tiến hành hai loạt thí nghiệm. Loạt I nhằm xác định độ lặp lại nội phản ứng, loạt II nhằm xác định độ lặp lại liên phản ứng.
Loạt thí nghiệm I nhằm xác định độ lặp lại nội phản ứng được tiến hành tại PTN
công ty Khoa Thương. Mẫu sử dụng là tế bào CaSki với mật độ là 106tế bào/ml. Trong
loạt thí nghiệm này, kết quả được xác định dựa trên quan sát dưới kính hiển vi về sự hiện diện của tế bào nhuộm màu nâu, đồng thời cường độ nhuộm miễn dịch cũng được đánh giá một cách chủ quan là cao +++, trung bình ++ và thấp +.