Quy trình ELISA sử dụng để phát hiện p16INK4A trong đề tài này được xây dựng
trên phương pháp ELISA “sandwich” gián tiếp (hình 73). Theo phương pháp này, kháng nguyên được “kẹp” (sandwich) giữa kháng thể “bắt giữ” cố định trên giếng và kháng thể “nhận biết” hiện diện trong dung dịch phản ứng. Mặt khác, việc đọc kết quả không được
88
thực hiện trực tiếp bằng kháng thể “nhận biết” mà qua trung gian một kháng thể “cộng hợp với enzyme” (gián tiếp) có khả năng nhận biết kháng thể “nhận biết”. Hệ thống ELISA “sandwich” gián tiếp được sử dụng vì kết hợp ưu điểm của hai kiểu tiếp cận :
Kiểu “sandwich”: (1) có độ đặc hiệu cao vì sử dụng hai kháng thể “bắt giữ” và
“nhận biết” đều đặc hiệu cho kháng nguyên, (2) phù hợp với mẫu có thành phần phức tạp vì không cần tinh sạch kháng nguyên trước, (3) có tính linh động, cho phép ứng dụng kiểu đọc kết quả “trực tiếp” lẫn “gián tiếp”.
Kiểu “gián tiếp” : (1) có độ nhạy cao vì một phân tử kháng nguyên có thể được
nhận biết bởi nhiều kháng thể “cộng hợp”, (2) có tính linh động vì có thể sử dụng một loại kháng thể “cộng hợp” cho nhiều kháng thể “nhận biết” khác nhau, (3) có hiệu quả kinh tế tốt vì không phải sử dụng nhiều loại kháng thể đánh dấu (Crowther, 2009).
Các thông số của quy trình ELISA “sandwich” gián tiếp phát hiện p16INK4Akhảo
sáttrong đề tài này bao gồm : nồng độ kháng thể bắt giữ, kháng thể phát hiện, kháng thể cộng hợp và nồng độ tác nhân khóa giếng.
Hình 73. Sơ đồ phương pháp ELISA “sandwich” gián tiếp
Bên cạnh việc xác định một số thông số tối ưu cho quy trình ELISA sử dụng
KTĐD 1C10 phát hiện p16INK4A tạo được từ đề tài, chúng tôi cũng đồng thời xác định các
thông số tối ưu tương tự cho một KTĐD thương mại, có tên là JC8 (Santa Cruz)nhằm mục tiêu xác định hiệu quả hoạt động của kit KTp16ELISA ở bước sau. Kháng thể đơn dòng thương mại JC8 (Santa Cruz) được sử dụng cho nghiên cứu. KTĐD này được chọn
89
dựa trên hiệu quả sử dụng đã được công bố từ nhiều công trình (Lassen & cs, 2009 ; NordiQC, 2009 ; Sawicka & cs, 2013).