Các công trình nghiên cứu về tạo và ứng dụng KTĐD và đa dòng kháng E6, E7 HPV 16 và 18 còn khá hạn chế. Sớm nhất có thể kể đến công trình tạo KTĐD trên chuột kháng protein E7 của HPV 16 của Tindle và cộng sự (1990). Công trình nghiên cứu
“Combination of anti-HPV 16 and 18 antibodies and uses thereof” của Zwerschke và
7
thương mại. Fiedler và cộng sự (2004) sử dụng kháng thể đa dòng thỏ kháng protein E7 HPV 16 đã được kiểm tra bằng Western blot và miễn dịch huỳnh quang trên các dòng CaSki, HeLa, U2-OS chuyển gene E7 HPV 16 để nghiên cứu mối liên quan giữa sự biểu hiện vượt mức protein E7 HPV 16 với sự giảm biểu hiện pRb trong sinh thiết cổ tử cung bằng phương pháp hóa mô miễn dịch. Peck và cộng sự (2006) trong một thông báo tóm tắt cho biết là đã phát triển được một strip test phát hiện protein E6 của HPV 16 dựa trên tương tác đặc hiệu của E6 với PDZ, phát hiện được 2,6 ng protein E6 tái tổ hợp. Một hướng phát triển khác tương tự nhưng ở dạng ELISA cũng trong thông báo trên cho biết có thể giảm mức phát hiện tới 30 pg E6/thử nghiệm. Nhiều công trình phát triển KTĐD kháng E6 và E7 HPV 16, 18 và sử dụng chúng để phát hiện protein E6, E7 tái tổ hợp và trong dịch tế bào tử cung (Ehehalt & cs, 2011).
Trong chẩn đoán HPV, có rất nhiều kit phát hiện các type HPV “nguy cơ cao/thấp”nhưng chỉ kit Hybrid Capture II là đã được FDA (Food and Drug Administration) công nhận cho sử dụng vào chẩn đoán thường quy. Một kit khác đang được thử nghiệm rộng rãi tại Hoa kỳ, Canada, Nam Phi và được chính thức cho lưu hành tại Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha là kit HPV OncoTect (Invirion Diagnostics). Kit này định lượng mRNA E6 và E7 trong tế bào biểu mô cổ tử cung dựa trên nguyên lý flow cytometry. Trong lĩnh vực miễn dịch học HPV, có nhiều kháng thể kháng protein E6 và E7 của HPV 16, 18 đã được thương mại hóa (Santa Cruz Biotechnology, Abcam, HyTest, Genway, AbD Serotec, Novus Biologicals, Lifespan Biosciences, Amynon Biotech), nhưng chủ yếu được ứng dụng trong nghiên cứu, chưa dùng cho chẩn đoán.
Nhiều công trình cho thấy việc sử dụng p16INK4A cho phép tăng hiệu quả của chẩn
đoán tế bào học cho các trường hợp tiền UTCTC. Protein p16INK4A trong chẩn đoán
“cervical intraepithelial neoplasia” có độ nhạy là 33%, độ đặc hiệu là 93%, giá trị tiên đoán dương là 93% và giá trị tiên đoán âm là 58% trong một công trình nghiên cứu trên 136 bệnh phẩm (Walts & cs, 2009). Một công trình khác tiến hành trên 232 mẫu Thin-
prep cho thấy trên nhóm ASCUS, độ đặc hiệu của chẩn đoán p16INK4A và HR-HPV DNA
PCR lần lượt là 42 % và 27 %. Điều này có nghĩa là 18 người (42 %) sẽ tránh được việc
theo dõi không cần thiết nếu sử dụng p16INK4A so với 6 người (27%) nếu sử dụng HR-
HPV DNA test (Schledermann & cs, 2008). Trong một công trình nghiên cứu diễn tiến
bệnh ở các trường hợp LSIL đi kèm với tăng cường biểu hiện p16INK4A cho thấy các bệnh
8
vậy việc can thiệp tức thì sẽ có ích lợi lớn cho các bệnh nhân này (Di Stefano & cs,
2010). Nhiều công trình cho thấy có mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của p16INK4
và mức độ bất thường tế bào học (Norman & cs, 2007 ; Lee & cs, 2012). Một công trình tiến hành với sự tham gia của 12 nhà bệnh học đánh giá độc lập 500 mẫu mô cổ tử cung và so sánh với “chuẩn vàng” do 3 chuyên gia về bệnh học phụ khoa thiết lập. Kết quả cho
thấy việc bổ sung thêm xét nghiệm miễn dịch p16INK4A làm tăng khả năng phát hiện chính
xác và lặp lại các trường hợp CIN “high-grade” một cách có ý nghĩa thống kê, làm tăng độ nhạy lên 13%, giảm phân nửa các trường hợp âm tính giả (Klaes & cs, 2003 ;
Bergeron & cs, 2010). Nhìn chung, p16INK4A được xem là một chỉ thị hữu ích, bổ sung
cho xét nghiệm tế bào học, đặc biệt trong các trường hợp Pap không rõ ràng, giúp phát hiện các trường hợp CIN (Cervical Intraepithelial Neoplasia “high grade” từ các ca ASC- US (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance) và LSIL (Low Grade of Squamous Intraepithelial Lesion)(Schledermann & cs, 2008 ; Kurshumliu & cs, 2009).
Kit CINtec p16INK4A Cytology (mtm) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn thử nghiệm
Papillomavirus-nguy cơ cao (HR-HPV) trong việc phát hiện CIN “high-grade” trên những mẫu Pap thuộc nhóm ASC-US hay LSIL (Reuschenbach & cs, 2010 ; Denton & cs, 2010).
Phương pháp Immuno-PCR:
Đây là phương pháp tận dụng độ nhạy cao của PCR và tính linh hoạt của phương pháp ELISA để phát hiện một protein xác định, do Sano và cộng sự đề xuất năm 1992. Trong phương pháp này, kháng thể nhận biết đặc hiệu kháng nguyên được cộng hợp với một trình tự DNA dùng làm chỉ thị (marker). Trình tự DNA này được nhân bản bằng PCR và sản phẩm nhân bản sẽ được phát hiện bằng nhiều phương pháp. Kết quả là ngưỡng phát hiện của immuno PCR tăng lên 100 – 10.000 lần so với ELISA (Niemeyer, 2005 ; Malou &cs, 2011) (hình 1). ImmunoPCR được ứng dụng để phát hiện kháng nguyên với độ nhạy cao (Niemeyer &cs, 2007)
Phương pháp này bao gồm nhiều cách tiếp cận : (1) Kháng thể bắt giữ đặc hiệu kháng nguyên được cố định lên hạt nano hay lên giếng ELISA, kháng nguyên hiện diện trong mẫu sau khi được bắt giữ sẽ được phát hiện bằng kháng thể cộng hợp với một trình tự DNA ; (2) Cố định kháng nguyên trực tiếp lên giếng ELISA và phát hiện bằng kháng thể
9
cộng hợp với một trình tự DNA dùng để phát hiện trực tiếp kháng nguyên hiện diện trong lát cắt mô, tế bào (Adler& cs, 2008).
Hình 1. ELISA và immuno PCR. Nguyên lý (A) và độ nhạy (B) của hai phương pháp
Một số công trình trong nước về KTĐD có thể kể là : công trình tạo KTĐD INNNV ở tôm (Bùi Thị Bích Hằng & cs, 2008), đề tài “Nghiên cứu tạo bộ kit ELISA định lượng Alpha-fetoprotein (AFP) trong huyết thanh để hỗ trợ chẩn đoán bệnh ung thư tế bào gan (HCC) ở người” (Đỗ Thị Thảo, 2010-2011); đề tài “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán và điều trị bệnh ở người” (Lê Quang Huấn, 2012).
PHẦN 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Mục tiêu dài hạn của đề tài là phát triển một công nghệ mới ở Việt Nam, công nghệ kháng thể đơn dòng (KTĐD) phục vụ cho chẩn đoán và điều trị. Đối tượng nghiên cứu của đề tài là HPV (Human Papillomavirus), một loại virus có liên quan chặt chẽ với ung thư cổ tử cung.
Mục tiêu cụ thể bao gồm :
1. Hoàn chỉnh quy trình tạo KTĐD ở quy mô nhỏ và vừa, áp dụng để tạo KTĐD kháng
một số protein liên quan đến ung thư cổ tử cung như E7 HPV16/18, p16INK4A.
2. Ứng dụng các KTĐD đã tạo được để phát triển các phương pháp chẩn đoán dựa trên kỹ thuật immuno PCR và miễn dịch mô/ tế bào.
3. Xây dựng một số kit nhằm phát hiện sớm ung thư cổ tử cung dựa trên kỹ thuật immuno-PCR và hóa miễn dịch mô, tế bào.
10
PHẦN 3. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
3.1. VẬT LIỆU 3.1.1. Tế bào
Tế bào HeLa(ATCC- American Type Culture Collection), dòng tế bào ung thư cổ tử
cung có chứa bộ gene HPV 18, biểu hiện protein p16INK4A
Tế bào CaSki (ATCC), dòng tế bảo ung thư cổ tử cung có chứa bộ gene của HPV 16.
Tế bào C-33 A (ATCC), dòng tế bào ung thư cổ tử cung không chứa bộ gene HPV.
Tế bào MCF-7 (ATCC), dòng tế bào không biểu hiện protein p16INK4A
Tế bào u tủy P3X63Ag8.653 (ATCC) không sản sinh các chuỗi immunoglobin và mất
khả năng tổng hợp enzyme HGPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase).
Dòng tế bào lai 1D5 và 4H5 sản xuất KTĐD kháng protein E7 HPV18 được tạo ra
trong hợp tác giữaPTN SHPT–ĐH KHTN–ĐHQGTpHCM với Trung tâm Nghiên cứu Y sinh học Cordeliers - Đơn vị INSERM 255 (Pháp) năm 2006.
Tế bào CHO–K1 được nhận từ Phòng thí nghiệm Tế bào gốc – ĐHQG HCM, nuôi cấy
và bảo quản tại PTN SHPT – ĐHKHTN – ĐHQG HCM.
Các dòng tế bào được nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử (PTN SHPT) - bộ môn Di Truyền – khoa Sinh Học – trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên (ĐHKHTN) – ĐHQG HCM.
3.1.2. Chủng vi sinh vật
Chủng vi khuẩn dùng để dòng hoá : E. coli (Escherichia coli) DH5 F–,
ø80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rK–, mK+), phoA,
supE44, λ–, thi-1, gyrA96, relA1 (Promega).
Chủng vi khuẩn biểu hiện protein tái tổ hợp: E. coli BL21(DE3): F– ompT gal dcm
lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) (Promega).
3.1.3. Vector
Các vector biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli bao gồm: pET28a(+)
(Novagen), pE-SUMO3 (Life Sensor), pETM44 và pGAT (EMBL). Các vector này có
mang vùng T7 promoter để biểu hiện protein mục tiêu trong tế bào chất của E.coli. Các
vector này mang các đuôi dung hợp khác nhau: 6xHis (pET28(a)), 6xHis-protein MBP (pETM44), 6xHis-protein SUMO (pSUMO), 6xHis-protein GST (pGAT).
11
Vector pEGFP-E7: có mang toàn bộ gene E7 HPV 18 được chèn vào vị trí BglII và
SalI trong vùng MCS của vector pEGFP-C2, được tạo ra và bảo quản ở Phòng thí nghiệm
Sinh học phân tử - Đại học Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQGTPHCM. 3.1.4. Chuột thí nghiệm
Chuột BALB/C (Viện Pasteur Nha Trang): chuột cái 6-8 tuần tuổi.
Chuột BALB/CBYJ (Charles River Laboratories France): chuột cái 6-8 tuần tuổi.
3.1.5. Bệnh phẩm
Bệnh phẩm là mẫu dịch phết cổ tử cung lấy bằng que phết và cytobrush hay thu nhận trong dung dịch ThinPrep của bệnh nhân hoặc người đến khám ở các bệnh viện : Bệnh viện Ung bướu - Thành phố Hồ Chí Minh (4/2011 - 5/2011) ; Bệnh viện Phụ sản Bán công Bình Dương (10/2012 – 12/2012) ; Bệnh viện Thủ Đức (09/2012 – 10/2012) ; Bệnh viện Hùng Vương (02/2013 – 05/2013). Các mẫu thu nhận ở BV Hùng Vươngđược cung cấp với kết quả Pap test.