Sau khi cho dịch protein thô vào cột Ni2+, cần rửa cột để loại các protein không
phải là protein mục tiêu ra khỏi cột trước khi dung ly để thu nhận protein mục tiêu tinh sạch. Như vậy, dung dịch rửa cột phải có khả năng loại bỏ càng nhiều càng tốt các protein không phải là protein mục tiêu. Histidine hiện diện trong đuôi 6xHis của protein tái tổ
hợp có khả năng liên kết với Ni2+trong cột là nhờ sự có mặt của nhóm phụ imidazole
trong cấu tạo phân tử Histidine. Khi bổ sung imidazole ở nồng độ vừa phải vào dung dịch rửa cột thì các phân tử imidazole sẽ bám lên cột và loại bỏ những protein có ái lực yếu
với Ni2+trừ protein mục tiêu có mang đuôi 6xHis. Tuy nhiên, nếu imidazole được sử dụng
với nồng độ quá cao thì các phân tử imidazole sẽ cạnh tranh với cả protein mục tiêu. Điều này khiến protein mục tiêu cũng sẽ bị loại khỏi cột trong quá trình rửa. Đó là lý do chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ imidazole sử dụng cho dung dịch rửa cột. Phổ nồng độ imidazole khảo sát là 60 mM đến 150 mM dựa vào khuyến cáo của nhà sản xuất. Tiêu chí chọn lựa là nồng độ imidazole tối thiểu loại được tối đa các protein khác mà không ảnh hưởng đến protein mục tiêu, thể hiện qua kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant trên bản điện di SDS-PAGE. Chúng tôi khảo sát nồng độ imidazole trong dung dịch rửa cột cho cả hai protein từ hai vector tái tổ hợp pET-p16 và pSUMO-p16. Chúng tôi rửa cột 2 lần với từng dung dịch có nồng độ imidazole khác nhau. Dung dịch qua cột sau mỗi lần rửa được thu nhận thành một phân đoạn, mỗi phân đoạn tương ứng với 1 ml.
Kết quả điện di SDS-PAGE (hình 21) cho thấy ở cả hai mẫu rửa bằng dung dịch imidazole 60 mM (giếng 6, 7), bắt đầu có sự xuất hiện một số protein có kích thước khác protein mục tiêu, đồng thời protein mục tiêu cũng bắt đầu bị dung ly tuy không nhiều như
Vector pET28a(+)
Khảo sát dung dịch đệm của phản ứng để tìm ra buffer tốt nhất.
Khảo sát ảnh hưởng của các chất biến tính lên phản ứng cắt.
Vector pE-SUMO3
48
ở những nồng độ imidazole cao hơn. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ imidazole 60mM làm nồng độ imidazole rửa cột.
Hình 21. Kết quả khảo sát nồng độ imidazole cho vector pE-SUMO( A), pET28a(B).Giếng 1: Thang phân tử lượng protein, giếng 2,3,4: protein từ E. coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp được cảm ứng biểu hiện ở ba dạng tổng tan và tủa, giếng 5:protein thu được sau khi qua cột, giếng 6 -15: protein thu được sau khi rửa cột với các dung dịch imidazole 60mM (giếng 6, 7)
80mM (8, 9), 100mM (10, 11), 120mM (12, 13), 150mM (14, 15).
Bảng 15. Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant ảnh hưởng của nồng độ imidazole lên sự dung ly của protein mục tiêu