Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans
1.2.1. Chẩn đoán trực tiếp
1.2.1.1. Soi phát hiện nang nấm dưới kính hiển vi
Có thể phát hiện nang polysaccharide của nấm Cryptococcus trong mẫu xét nghiệm nước tiểu não, nước tiểu, đờm, mô hoặc các vật liệu bị nhiễm khác bằng cách nhuộm mực tàu hoặc các chế phẩm than keo và soi kiểm tra dưới kính hiển vi. Kết quả quan sát cho hình ảnh nấm C. neoformans là những tế
bào nấm men, hình cầu hoặc hình bầu dục, bao quanh là một lớp vỏ dày. Độ dày của lớp vỏ rất thay đổi. Nhuộm soi là phương pháp đơn giản nhất cho chẩn đốn tìm nấm trong dịch não tủy.
Ưu điểm của phương pháp nhuộm mực tàu là kỹ thuật thực hiện đơn giản, thời gian thực hiện nhanh, chỉ mất một vài phút. Nhược điểm là độ nhạy kém. Độ nhạy của phương pháp nhuộm mực tàu trong chẩn đoán Cryptococcus viêm màng não ở bệnh nhân không nhiễm HIV là xấp xỉ 30 đến 72% so với nuôi cấy. Độ nhạy trong chẩn đoán bệnh ở bệnh nhân nhiễm HIV là dưới 86%. Độ nhạy giảm xuốngchỉ còn42% khi thực hiện với các mẫu bệnh phẩm có mật độ < 1000 CFU/mL [38]. Giới hạn phát hiện của phương pháp này khoảng 103 đến 104 tế bào nấm/ml dịch não tủy [22], [38]. Độ nhạy có thể được tăng lên khi ly tâm dịch não tủy trước khi tiến hành làm tiêu bản và nhuộm mực tàu.
Với các lát cắt sinh thiết mô để phát hiện nấm Cryptococcus thường sử dụng các chất nhuộm PAS, HE, hoặc mucicarmine.
1.2.1.2. Nuôi cấy phát hiện nấm trên môi trường chọn lọc
Nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán viêm màng não do Cryptococcus, nhưng phương pháp này có một số nhược điểm. Các phương pháp ni cấy nấm địi hỏi cơ sở hạ tầng phịng thí nghiệm, điện, và kỹ thuật viên được đào tạo bài bản [39]. Nuôi cấy cần 7 ngày để nấm phát triển và ủ lên đến 10 ngày để có được số liệu đáng tin cậy. Các phương pháp ni cấy
cũng có thể tạo ra kết quả âm tính giả khi mật độ nấm thấp, hiệu suất chẩn đốn có thể được cải thiện bằng cách sử dụng lượng dịch não tủy cao hơn. Sử dụng 100 μL dịch não tủy khơng pha lỗng so với 10 μl pha loãng ở tỷ lệ 1:10 đã làm tăng độ nhạy từ 82,4% đến 94,2%, với mức tối thiểu đơn vị khuẩn lạc CFU cần thiết cho sự tăng trưởng giảm từ 100 xuống cịn 10 CFU/ml [38].
Ni cấy có thể được thực hiện trên nhiều mơi trường khác nhau nhưng phổ biến nhất là môi trường thạch Sabouraud dextrose; hoặc thạch máu, ngày nay thạch khác như thạch ớt đỏ (Ground red hot Pepper agar - GRHP) hay thạch GACA (Giuzotia abyssinica Creatinin agra) cũng được sử dụng thường quy để nuôi cấy máu.
Các bệnh phẩm máu hoặc dịch não tủy được cấy trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở 300C, đọc kết quả hàng ngày cho đến 14 ngày [19], [38]. Nấm mọc thành các khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu kem. Cấy máu có độ nhạy tới hơn 70% ở các trường hợp bệnh nhân AIDS.
Ngưỡng phát hiện của phương pháp nuôi cấy khác nhau phụ thuộc vào cách thức tiến hành xử lý trước khi nuôi cấy.
Bảng 1.1. Ngưỡng phát hiện của phương pháp nuôi cấy với các cách xử lý
mẫu khác nhau
STT Phương pháp xử lý mẫu Ngưỡng tối thiểu nấm có thể mọc được (CFU/ml)
1 Nuôi cấy thông thường (10 ml pha loãng 1:10)
100
2 100 ml khơng pha lỗng 10 3 Ly tâm mẫu và sử dụng cặn lắng 10 4 Lọc mẫu qua màng milipore 1