Các chỉ
tiêu chất lượng
Yêu cầu Mồi
ITS1 Mồi ITS4 Mồi CN4 Mồi CN5 Đánh giá Chiều dài 18-24 nu 19 20 22 22 Đạt Tỷ lệ CG 35-65% 63,16 40,00 40,91 54,55 Đạt Tm < 650C 61,4 56,6 59,1 63,2 Đạt Cặp mồi không chênh nhau > 50C 4,8 4,1 Đạt
Kết quả bảng 3.4 cho thấy các chỉ tiêu kỹ thuật của mồi ITS1, ITS4 cho PCR1; CN4, CN5 cho PCR2 đạt tiêu chuẩn chất lượng theo yêu cầu lựa chọn cặp mồi cho phản ứng PCR lồng.
3.1.2.2. Kết quả đánh giá tính đặc hiệu của mồi
Hình 3.5. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi ITS1-ITS4 bằng phần
mềm Primer Blast
So sánh trình tự mồi của từng cặp mồi với trình tự gen của nấm
C.neoformans bằng phần mềm Primer-Blast. Kết quả ở hình 3.5 chỉ ra cặp mồi ITS1, ITS4 của phản ứng PCR1 hoản tồn tương thích với trình tự gen của lồi nấm C. neoformans với kích thước sản phẩm PCR ước tính là 555 bp.
Hình 3.6. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi CN4-CN5 bằng phần mềm Primer Blast
Kết quả hình 3.6 khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi CN4 và CN5 bằng phần mềm Primer Blast cũng thể hiện tính tương thích 100% và độ dài sản phẩm PCR dự kiến là 135bp.
- Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của bộ mồi bằng thực nghiệm
+ Kết quả thực nghiệm giải trình tự
Tiến hành phản ứng PCR bằng cặp mồi đã lựa chọn với ADN của mẫu chủng chuẩn C. neoformans ATCC® 90113. Sau đó giải trình tự sản phẩm PCR rồi so sánh kết quả giải trình tự với các trình tự chuẩn đã được công bố trên GeneBank thông qua phần mềm ClustalX. Sử dụng chương trình Blast trên NCBI để tìm kiếm trình tự tương đồng với đoạn trình tự đã giải. Kết quả
đồng 99% đến 100% so với các trình tự của C. neoformans được lưu giữ trên ngân hàng gen. (Hình 3.7)
Hình 3.7. So sánh trình tự ADN nấm chuẩn được khuếch đại bởi cặp mồi
+ Kết quả thực nghiệm trên các nền mẫu khác nhau