Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.5. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
+ Bệnh nhân được chọc dịch não tủy theo quy trình của Bộ Y tế. Mỗi bệnh nhân thu thập 1-3 ống, mỗi ống ít nhất 2 ml dịch não tủy. Tất cả các mẫu dịch não tủy được mã hóa, ghi chép các thơng tin: Họ tên, tuổi, địa chỉ, ngày khởi bệnh, ngày vào viện, một số thông tin về tiền sử phơi nhiễm, một số hội chứng nếu cần thiết, ngày thu thập mẫu, loại bệnh phẩm [85].
+ Mẫu dịch não tủy chẩn đốn hình thái, ni cấy cần được vận chuyển càng sớm, càng tốt đến phịng thí nghiệm.
+ Mẫu dịch não tủy sử dụng để phân tích bằng kỹ thuật sinh học phân tử được bảo quản 4oC ở phịng thí nghiệm cho đến khi phân tích. Nếu trong vịng 24 giờ chưa phân tích được thì chuyển bảo quản dịch não tủy ở nhiệt độ - 20oC
2.3.5.2. Kỹ thuật điều chế môi trường
Điều chế môi trường nuôi cấy nấm
Sử dụng môi trường Sabouraud Dextrose Agar (Merk, Đức) có kháng sinh gentamycin để ni cấy nấm C. albicans và C. neoformans. Cách thức điều
chế 1 lít mơi trường tóm tắt trong các bước sau:
- Cân 65g bột môi trường Sabouraud Dextrose Agar cho vào bình tam giác hoặc chai thủy tinh (có chia vạch thể tích);
- Sử dụng cốc đong nước cất đổ vào bình ở trên sao cho đủ 1 lít;
- Dùng que thủy tinh khuấy đều mơi trường trong nước cất rồi đưa bình vào trong nồi hấp để hấp ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút;
- Khi máy báo nhiệt độ trong nồi hấp cịn 65-70o, lấy bình ra và cho kháng sinh gentamycin (kháng sinh đã được làm tan trước đó), rồi lắc đều;
- Tiếp theo đổ dung dịch vào đĩa thạch hoặc ống thạch; - Chờ cho thạch đông rồi bảo quản đĩa và ống thạch ở 4oC;
A B
Hình 2.2. Mơi trường thạch Sabouraud trên đĩa thạch và ống thạch nghiêng
Đối với vi khuẩn
Trong nghiên cứu này các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm các tác nhân là vi khuẩn N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumonia,Escherichia coli, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa không tiến hành tăng sinh trên môi trường. Mẫu
bệnh phẩm thu thập hoặc dịch treo vi khuẩn (trong NaCl 0.9%) được bất hoạt ở 56oC. ADN được tách chiết từ dịch treo và được bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.
2.3.5.3. Kỹ thuật nuôi cấy trên môi trường thạch Sabouraud
Ria cấy dày trên mặt thạch Sabouraud theo phương pháp 3 vùng. Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC, trong 3- 5 ngày hoặc có thể lâu hơn. Quan sát khuẩn lạc hàng ngày trong q trình ni cấy. Mẫu được xác định là dương tính với C. neoformans khi xuất hiện các khuẩn lạc đặc trưng lồi, mịn nhẵn,
nhày, màu trắng, kem hoặc hồng, vàng [86].
2.3.5.4. Kỹ thuật nhuộm mực tàu (China ink)
Lấy một ít khuẩn lạc cho lên lam kính. Nhỏ 1 - 2 giọt mực tàu, dùng kim cấy trộn đều mực tàu với khuẩn lạc.Quan sát vi thể: Ở độ phóng đại thấp, các tế bào C. neoformans giống các đốm sáng nhỏ; quan sát ở độ phóng đại cao hơn sẽ phát hiện tế bào nấm men có nhân chiết quang rõ, bao quanh bởi một
quầng sáng có các tế bào nấm men hình trịn hoặc bầu dục. Hình ảnh đặc trưng trên tiêu bản nhuộm mực tàu là các điểm sáng hình cầu với bao ngồi sáng và có nhân bên trong.
Các mẫu bệnh phẩm sau khi ni cấy xác định dương tính với nấm C. neoformans, sẽ được lưu giữ trong môi trường tryptic soy broth + 15%
glyceron ở -80oC đến khi sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.5.5. Kỹ thuật tăng sinh chủng nấm chuẩn từ mẫu chuẩn của nhà cung cấp
Theo hướng dẫn của nhà cung cấp cụ thể như sau (www.atcc.org/products/all/90113.aspx) (phụ lục): + Bẻ ống thủy tinh chứa chủng của nhà cung cấp;
+ Thêm vào trong ống chủng vừa bẻ nắp 0,5 ml đến 1 ml nước cất 2 lần vô
trùng, trộn đều tạo thành dung dịch huyền phù;
+ Hút hết dung dịch huyền phù trên cho vào ống falcon có chứa 5 ml đến 6 ml nước cất 2 lần nước cất 2 vô trùng;
+ Ủ ở nhiệt độ phòng 250 C tối thiểu 2 giờ;
+ Trộn đều hỗn dịch, sau đó lấy một vài giọt để ni cấy trên môi trường thạch
đĩa phù hợp, nhiệt độ ủ từ 240C đến 260C;
+ Kiểm tra đĩa nuôi cấy thường xuyên, thông thường khoảng sau 12 ngày sẽ xuất hiện khuẩn lạc.
Khuẩn lạc của chủng chuẩn mọc lên trên đĩa thạch được lấy lưu giữ trong môi trường tryptic soy broth + 15% glyceron ở -80oC.
Khi cần thí nghiệm hoặc tách chiết ADN thì khuẩn lạc của chủng chuẩn được chuyển sang các điều kiện bảo quản phù hợp từ -80oC sang -20oC sang 0oC, tiếp tục là 2-8oC mỗi điều kiện nhiệt độ cần lưu giữa khoảng 12 giờ để duy trì sự phát triển tốt nhất của nấm và cuối cùng để ổn định ở nhiệt độ phòng 250 C cấy ra ống thạch nghiêng hoặc đĩa thạch.
2.3.5.6. Tạo panel theo nồng độ dịch treo
+ Lấy ống đựng dung dịch lưu giữ các chủng nấm từ tủ ấm sâu ra rồi cho vào tủ 40C để trong 2 giờ;
+ Đưa dung dịch lưu giữ nấm ở tủ 40C ra để nhiệt độ phòng trong 2 giờ;
+ Dùng que cấy vô khuẩn lấy dịch lưu trữ cấy lên ống thạch nghiêng để tăng sinh các chủng vi nấm, ghi tên chủng và ngày tháng tăng sinh;
+ Sau 2-3 ngày, thu khuẩn lạc cho vào nước muối sinh lý để tạo thành các dung dịch treo ban đầu và hiệu chỉnh dịch treo về 0,5 MacFarland (tương đương với 1-5 x106CFU/ml);
+ Các dịch treo của các vi nấm sau đó được đo quang tính tốn mật độ tế bào nấm theo đơn vị CFU;
+ Hịa lỗng bằng nước cất để giảm nồng độ dịch treo và hiệu chỉnh về các nồng độ 105 CFU/ml, 104CFU/ml, 103CFU/ml, 102 CFU/ml, 10 CFU/ml [87]; + Tiếp theo lấy 500µl dịch treo của nấm các nồng độ trên để tách ADN.
Hình 2.3. Phương pháp pha loãng dịch não tủy
(Nguồn: Dyal 2016) [87]
2.3.5.7. Tạo panel theo nồng độ ADN các vi nấm để đánh giá độ nhạy và ngưỡng phát hiện
Các bước tạo panel theo nồng độ ADN các vi nấm:
+ Dùng que cấy vô khuẩn lấy khuẩn lạc vi nấm cho vào 500µl dung dịch nước muối sinh lý;
+ Thu ADN và đo nồng độ ADN thu được bằng thiết bị Nano 1000;
+ Hịa lỗng ADN đã biết nồng độ mỗi 2 lần, 5 lần và 10 lần trong nước khử ion để thu được dung dịch ADN có nồng độ nhỏ hơn nồng độ ban đầu;
+ Mỗi nồng độ được tạo thành 5-10 tube;
+ Tạo 10 mức nồng độ khác nhau của mỗi loại nấm; + Lưu giữ nồng độ ADN ở tủ đá cho đến khi sử dụng;
2.3.5.8. Tạo panel để đánh giá độ đặc hiệu
ADN của các chủng vi khuẩn, vi nấm không phải C. neoformans, ADN người sẽ thêm nước khử ion được tạo ra để làm panel đánh giá độ nhạy. 13 mẫu panel đã được tạo ra để đánh giá độ nhạy của các kỹ thuật PCR và các bộ sinh phẩm tạo ra.
2.3.5.9. Kỹ thuật tách chiết ADN vi khuẩn
ADN tổng số của vi khuẩn được tách chiếtbằng bộ sinh phẩm QiAamp® DNA mini kit của hãng QIAGEN (Code 51304, Đức). Quy trình được tóm tắt như sau:
Bước 1. Lấy 1 ml dịch não tủy cho vào ống eppendorf. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút (hoặc 8000 vòng/15 phút), giữ cặn, loại bỏ dịch nổi.
Bước 2. Thêm 180 μl dung dịch đệm ATL vào tube chứa cặn bên trên. Sau đó
tiếp tục thêm 20 μl proteinase K, trộn đều bằng máy vortex và ủ ở nhiệt độ 56oC trong máy lắc rung 10-20 phút. Chuyển bước 3.
Bước 3. Ly tâm ống chứa mẫu trong thời gian ngắn để làm cho những giọt
nước từ trên nắp bên trong tube rơi xuống.
Bước 4. Thêm 200 μl đệm AL vào mẫu, trộn đều bằng máy vortex trong 15
giây và ủ ở 70 oC trong 10 phút. Ly tâm 8000vòng/phút trong thời gian ngắn.
Bước 5. Thêm 200 μl ethanol (96-100%) vào mẫu, trộn đều bằng máy vortex
Bước 6. Cẩn thận chuyển hỗn dịch thu được ở bước 6 (bao gồm cả cặn) vào
cột lọc QIAamp Mini (loại 2 ml) sao cho khơng ướt ống. Đóng nắp và ly tâm ở 8000vòng/phút trong 1 phút. Đặt cột lọc QIAamp trong một ống thu mẫu sạch loại 2 ml và loại bỏ ống chứa phần nước vừa lọc.
Bước 7. Cẩn thận mở nắp cột lọc QIAamp Mini và thêm 500 μl đệm AW1.
Đóng nắp, ly tâm 8000 vịng/phút trong 1 phút và loại bỏ cặn vừa ly tâm.
Bước 8. Cẩn thận mở nắp cột lọc và cho vào đó 500 μl AW2. Đóng nắp và ly
tâm ở tốc độ tối đa 14000 vòng/phút trong 3 phút.
Bước 9. Đặt cột lọc trong một ống ly tâm sạch loại 1,5 ml và loại bỏ ống chứa
dịch vừa ly tâm. Cẩn thận mở nắp ống QIAamp Mini và thêm 200 μl đệm AE hoặc nước khử ion vào tube. Ủ ở nhiệt độ phịng trong thời gian 1 - 2 phút sau đó ly tâm 8000 vịng/phút trong 1 phút.
Bước 10. Thu dung dịch ADN bên dưới, ký hiệu mẫu và tiến hành kiểm tra
nồng độ ADN thu được.
2.3.5.10. Kỹ thuật tách chiết ADN vi nấm
ADN của vi nấm được tách chiết bằng bộ sinh phẩm Fungi/Yeast Genomic DNA Isolation Kit của hãng Norgen (Cat. # 27300, Norgen Biotek Corp). Quy trình tách chiết tóm tắt như sau:
Chuẩn bị mẫu: Lấy một đến hai khuẩn lạc của nấm C. neoformans sau khi
nuôi cấy pha vào dung dịch nước cất sạch để tạo thành các dung dịch treo. Các dịch treo sau đó được đo quang theo mẫu chuẩn với một thể tích nhất định để tính chỉ số CFU và hiệu chỉnh dịch treo về 0,5 MacFarland (tương đương với 106CFU/ml).
Hịa lỗng bằng nước cất để giảm nồng độ dịch treo và hiệu chỉnh về các nồng độ 105 CFU/ml, 104CFU/ml, 103CFU/ml, 102 CFU/ml.
Bước 1. Lấy 500µl dịch treo nấm C. neoformans của từng nồng độ như trên
để vào 1 ống eppendorf 1.5 ml. Ly tâm 14,000 rpm trong 1 phút, giữ cặn, loại bỏ dịch nổi.
Bước 2. Thêm 250µl Resuspension Solution A, vortex nhẹ. Thêm 20µl
enzyme Lyticase, ủ 30˚C trong 45 phút. Thường xuyên lắc trong quá trình ủ.
Bước 3. Thêm 500 µl Lysis Buffer L và 5 µl RNase A vào tube rồi vortex để
hòa tan.
Bước 4. Chuyển hỗn hợp vào ống Bead Tube, tiến hành vortex ở tốc độ tối đa
trong 5 phút.
Bước 5. Đưa ống Bead Tube vào bể ổn nhiệt và ủ ở 65˚C trong 10 phút, lắc 2
– 3 lần trong quá trình ủ.
Bước 6. Ly tâm nhẹ ống Bead tube sau đó chuyển tất cả dung dịch nổi phía trên
bao gồm cả các tế bào vào ống eppendorf. (Không được lấy các hạt trong Bead Tube).
Bước 7. Ly tâm 14,000 rpm/2 phút, chuyển dịch nổi sang ống mới.
Bước 8. Thêm một lượng cồn bằng với lượng dịch nổi vừa hút, trộn đều. Sau
đó tiếp tục thêm 300 µl Solution BX và trộn đều bằng máy vortex.
Bước 9. Hút 650 µl hỗn hợp vào cột lọc, ly tâm 10,000 rpm/1 phút, bỏ dịch
phía dưới. Sử dụng ống cũ, thực hiện như trên với phần hỗn hợp còn lại.
Bước 10. Thêm 500 µl Wash Solution A vào cột lọc. Ly tâm 10,000 rpm
trong 1 phút. Bỏ dịch phía dưới, sử dụng ống cũ. Lặp lại bước trên, sau đó ly tâm 14,000 rpm trong 2 phút và loại bỏ phần dịch phía dưới.
Bước 11. Chuyển cột lọc vào một ống Elution 1.7 ml. Thêm 100 µl Elution
Buffer B, ly tâm 10,000 vịng trong 2 phút. Nếu khơng thu được tồn bộ thể tích thì ly tâm thêm 1 phút nữa.
2.3.5.11. Kỹ thuật đo nồng độ ADN
Dung dịch ADN thu được được kiểm ra nồng độ trên máy NanoDrop 2000. Các bước như sau:
+ Khởi động máy tính kết nối với thiết bị;
+ Click đúp vào biểu tượng phần mềm của thiết bị Nanodrop 1000 trên Desktop. Một cửa số giao diện của phần mềm hiện ra.
+ Tiếp tục Click vào biểu tượng Nucleotid, khi đó có một cửa sổ giao diện mới hiện ra;
+ Bật nắp mắt quang của thiết bị, nhỏ 1 µl nước khử ion vào “mắt” của thiết bị, đóng nắp và click chuột vào vị trí OK trong cửa số mới trên máy tính; + Dùng khăn giấy lau nước mắt thiết bị và nhỏ tiếp 1 µl. Đóng nắp mắt thiết bị và bấm Blank trên cửa số giao diện của phần mềm hiện ra trên máy tính;
+ Dùng khăn giấy khô lau nước trên mắt thiết bị và nhỏ 1 µl dung dịch ADN cần đo vào đó. Đóng nắp thiết bị và Click chuột vào Measurement. Vài giây sau, kết quả sẽ hiện ra trên máy tính với các thơng số chính: nồng độ, chỉ số OD (A260nm/A280nm)… Khi A260nm/A280nm nằm trong khoảng 1.8 -2.0, dịch chiết ADN được xem là có độ tinh sạch tốt.
+ Các mẫu tiếp theo cần đo lặp lại như ở bước trên;
+ Kết thúc đo, kết quả đo được ghi chép và lưu trên máy tính;
ADN thu được được kiểm tra nồng độ sau đó bảo quản ở -20oC cho tới khi đem sử dụng làm cơ chất cho phản ứng PCR.
2.3.5.12. Kỹ thuật lựa chọn mồi cho phản ứng nested – PCR
Tham khảo các cặp mồi đã được công bố, lựa chọn 02 cặp mồi phù hợp cho phản ứng nested – PCR đáp ứng các yêu cầu: Độ dài tối ưu của mồi từ 18-24 bazơ nitơ hay nucleotit. Tỷ lệ G + C chiếm 35-65%. Tránh các nucleotide lặp lại, nhiệt độ nóng chảy (melting Temperatures - Tm) tương tự
nhau, không chênh quá 50C. Mồi của phản ứng PCR lần 2 có trình tự nằm trong trình tự của sản phẩm PCR lần 1.
Phản ứng PCR lần 1: Chọn và đánh giá cặp mồi theo tác giả Mitchell và cs (1994) [42]; Mirhendi và cs, (2001) [44] là ITS1 và ITS4.
Phản ứng PCR lần 2: Chọn và đánh giá cặp mồi theo Guizhen Luo và cs (2002) là CN4 và CN5 [88].
2.3.5.13. Kỹ thuật đánh giá tính đặc hiệu của mồi
Tính đặc hiệu của cặp mồi được khảo sát bằng cách:
+ Sử dụng cặp mồi đã lựa chọn chạy phản ứng PCR với ADN của nấm C. neoformans, sản phẩm PCR được giải trình tự và so sánh trên ngân hàng gen.
+ Tiến hành thực nghiệm phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đã lựa chọn với các ADN khuôn khác không phải của nấm C. neoformans.
2.3.5.14. Kỹ thuật PCR với cặp mồi đã lựa chọn
Thực hiện phản ứng PCR theo quy trình thơng thường tiến hành để khuếch đại đoạn gen có kích thước từ 200 đến 800 bp với tổng thể tích 50μl
2.3.5.15. Kỹ thuật điện di
Điện di 45 phút trên thạch Agarose 2% trong môi trường TBE 0,5M ở điện thế 100V phân tích dựa vào thang ADN chuẩn 100bp.
2.3.5.16. Kỹ thuật giải trình tự sản phẩm PCR
+ Tinh sạch sản phẩm PCR chuẩn bị cho giải trình tự: Sử dụng bộ kít tinh sạch ADN của hãng Omega để tinh sạch ADN từ sản phẩm PCR.
+ Tiến hành phản ứng PCR với bộ sinh phẩm Bigdye theo hướng dẫn của bộ sinh phẩm:25 chu kỳ: 960C trong 10 giây; 590C trong 5 giây; 600C trong 2 phút và bảo quản ở 40C đến khi sử dụng.
+ Giải trình tự tự động trên máy ABI 3130: Sản phẩm sau khi chạy bigdye được nạp vào máy đọc trình tự tự động ABI 3130.
+ Trình tự thu được được so sánh với ngân hàng gen để khẳng định gen nhân được là của C. neoformans.
2.3.5.17. Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng PCR1
Phản ứng PCR1 được thực hiện với tổng thể tích 25μl sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4 với các thành phần như bảng 2.2 và chu trình nhiệt như bảng 2.3
Bảng 2.2. Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR
TT Thành phần Nồng độ, hàm lượng cuối cùng
Thể tích sử dụng cho 1 phản ứng (µl) 1 Nước khử ion Vừa đủ tới 25 µl 9,5
2 Master Mix 2 X có chứa MgCl2 nồng độ 4 mM
1X 12,5
3 Mồi xi PCR1 0,02 µM 1 4 Mồi ngược PCR1 0,02 µM 1 5 ADN khn 100pg – 100ng/25µl 2
Phản ứng PCR được tiến hành theo các bước như bảng sau đây:
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt PCR1 được thiết lập cho việc nhân bản đoạn gen
kích thước khoảng 100bp - 600 bp
Bước phản ứng Nhiệt độ 0C Thời gian Số chu kỳ