Giếng 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10: Mẫu nhiễm nấm C. neoformans Giếng 5: Thang chuẩn 50 bp
Giếng 6: Chứng âm
Giếng 7: Chứng dương – chủng chuẩn ATCC®90113 C. neoformans
3.1.3.4. Kết quả xác định các điều kiện cho phản ứng PCR2
Khi thực nghiệm phản ứng PCR lần 2 theo quy trình chuẩn của phản ứng PCR để sản phẩm băng ADN có kích thước từ 100 đến 600 bp với lượng ADN khuôn ban đầu đưa vào thực nghiệm là 1 ng/1 phản ứng thì kết quả sản phẩm PCR có các băng dày, đậm. Điều này chứng tỏ lượng ADN khn đưa vào có thể q lớn. Do đó chúng tơi tiến hành thực nghiệm phản ứng PCR giữ nguyên các thành phần phản ứng khác, nhưng pha loãng sản phẩm PCR1 theo tỷ lệ 1:10 từ 1 ng (1000 pg) giảm xuống 100 pg, 10 gp và 1pg để thử nghiệm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kết quả lựa chọn nồng độ ADN khuôn cho phản ứng PCR2 STT Nồng độ STT Nồng độ mẫu thử nghiệm Số lần lặp lại Sản phẩm PCR – 135 bp Chất lượng băng Có băng ADN đúng kích thước Khơng có băng ADN đúng kích thước 1 1 pg 15 3 12 Mảnh, mờ 2 10 pg 15 12 3 Mảnh, mờ 3 100 pg 15 15 0 Băng rõ 4 1000 pg 15 15 0 Băng đậm, nhòe Qua bảng 3.12 nhận thấy có thể lựa chọn ADN khuôn cho phản ứng khoảng nồng độ 100 pg (0,1ng) là kết quả phù hợp.
- Kết quả chuẩn hóa nồng độ Mg2+
Thực nghiệm phản ứng PCR2 với 08 mẫu (01 mẫu chuẩn mã ATCC 90113 và 07 chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam) ở 6 nồng độ Mg2+
khác nhau, kết quả được thể hiện ở bảng 3.13
Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR2
TT Nồng độ ADN khuôn
Số lượng mẫu lên băng 135bp với nồng độ Mg2+ khác nhau (mM) 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 1 1 pg 0/8 6/8 7/8 7/8 7/8 7/8 2 10 pg 1/8 6/8 8/8 7/8 7/8 6/8 3 100 pg 1/8 7/8 8/8 7/8 6/8 8/8 4 1000 pg 1/8 7/8 8/8 7/8 6/8 6/8
Kết quả bảng 3.13 cho thấy ở Mg2+ nồng độ 2,0 mM và nồng độ ADN ≥ 10 pg thì tất cả mẫu xét nghiệm đều có sản phẩm PCR.
Hình 3.10. Sản phẩm PCR theo nồng độ Mg2+
Giếng 1: Mg2+: 3,5 mM; Giếng 2: Mg2+: 3,0 mM Giếng 3: Mg2+: 2,5 mM Giếng 4: Mg2+: 2,0 mM Giếng 5: Mg2+: 1,5 mM Giếng 2: Mg2+: 1,0 mM
Giếng 7: Chứng âm Giếng 8: Thang chuẩn 100 bp
Nhận thấy ở hình 3.10 khi điện di sản phẩm PCR của 6 nồng độ Mg2+
khác nhau, kết quả cho thấy sản phẩm PCR ở nồng độ 2,0 mM có băng thanh mảnh, rõ nét và đẹp nhất.
Qua kết quả phân tích trên bảng 3.13 và hình 3.10 lựa chọn nồng độ Mg2+, để tiến hành phản ứng PCR là 2,0 mM.
- Kết quả chuẩn hóa chu trình nhiệt của phản ứng PCR 2
+ Chuẩn hóa nhiệt độ bám mồi