Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.3.1. Xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm C. neoformans
- Chuẩn bị mẫu
+ Thu thập 270 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân viêm màng não tại 04 bệnh viện ở Việt Nam sau đó ni cấy phân lập được 51 chủng nấm C. neoformans, chọn 07 chủng để xây dựng quy trình;
+ Tăng sinh tạo nguồn chủng từ chủng nấm C. neoformans chuẩn ATCC
90113;
+ Tạo panel dịch treo nấm của chủng chuẩn và chủng phân lập ở Việt Nam; + Tách chiết ADN của chủng nấm C. neoformans chuẩn và của các chủng
phân lập ở Việt Nam;
+ Tách chiết ADN của vi khuẩn, các nấm men khác Cryptococcus neoformans, HBV, ADN người để làm ADN chuẩn âm;
+ Giám định phân tử các chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam; + Giám định phân tử các vi khuẩn làm chuẩn âm;
+ Tạo panel ADN của chủng chuẩn và chủng phân lập ở Việt Nam.
- Xây dựng quy trình kỹ thuật nested-PCR xác định nấm C. neoformans
Lựa chọn cặp mồi phù hợp, tối ưu hóa thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của kỹ thuật nested-PCR. Các nội dung chủ yếu bao gồm:
+ Lựa chọn cặp mồi phù hợp cho phản ứng PCR1 và PCR2
+ Chuẩn hóa thành phần của phản ứng PCR1 và PCR2 (như mục 2.3.5.17)
+ Chuẩn hóa chu trình nhiệt của phản ứng PCR1 và PCR2 + Xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested-PCR.
- Xây dựng bộ sinh phẩm nested-PCR xác định C. neoformans Tạo chuẩn dương và chuẩn âm
+ Chuẩn dương của C.neoformans được tạo từ chủng nấm chuẩn ATTC
90113: Cấy chuyển, tách chiết, đo nồng độ, tạo ngân hàng với nồng độ thích hợp: Lấy 5 mẫu nấm chuẩn đã được cấy chuyển, tách chiết ADN với lượng mẫu lớn – thu được ít nhất 1ml ADN sau khi đã tách chiết, đo nồng độ trung bình đạt khoảng 11 ng/µl – Từ nồng ADN nấm chuẩn ban đầu, lấy 1 thể tích nhất định pha loãng với nước khử ion theo bậc thang 2 (5 lần), bậc thang 5 (3 lần) và bậc thang 10 (4 lần) để tạo ra dãy chuẩn dương có nồng độ khác nhau. Sử dụng dãy chuẩn dương tiến hành phản ứng PCR để xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng. Chuẩn dương sử dụng cho bộ kít được lựa chọn cao hơn ngưỡng phát hiện 1 lần: ví dụ nếu ngưỡng phát hiện của phản ứng là 10-2ng/µl (10pg/ µl) thì chứng chuẩn dương nên sử dụng ở mức 100 pg/ µl.
+ Chứng chuẩn âm là các ADN được tách chiết từ dịch não tủy của người khơng nhiễm nấm C.neoformans, có thể nhiễm các KST khác: Các mẫu này đã được xác định không nhiễm nấm bằng nuôi cấy và kỹ thuật PCR. Các mẫu chuẩn âm cũng có nồng độ tương tự với nồng độ của chứng chuẩn dương nếu có mang các ký sinh trùng khác.
Chuẩn bị hỗn hợp PCR cho bộ kít
Dự kiến xây dựng bộ sinh phẩm cho việc thực hiện 100 phản ứng PCR với hai hình thức đóng gói.
Dạng 1: Gồm 02 loại hỗn hợp phản ứng (master mix) với đầy đủ các thành
phần của phản ứng PCR lần 1 và phản ứng PCR lần 2; chỉ cần thêm ADN khuôn vào là thực hiện phản ứng PCR.
Dạng 2: Gồm nhiều loại hỗn hợp phản ứng được chia ra một cách hợp lý các
thành phần trong các tube, khi thực hiện sẽ hướng dẫn trộn các hỗn hợp phản ứng với nhau theo các tỷ lệ nhất định và thêm ADN khuôn để thực hiện phản
ứng PCR.
Hỗn hợp phản ứng được bảo quản trong các ống nhựa sạch khơng chứa DNAase và RNAase thể tích 2,0 ml nắp xoắn.
Số phản ứng là 100 nhưng thực tế chuẩn bị khoảng 120 phản ứng nhằm đảm bảo cho kiểm tra bộ kít và hao hụt trong q trình thao tác.
Lựa chọn dạng đóng gói của bộ sinh phẩm
Với mỗi dạng kit lấy 01 bộ kít để đánh giá tính ổn định ngay sau khi sản xuất sau 1 tuần, 1 tháng với 20 mẫu đã được xác định là dương tính với dịch não tủy và 10 mẫu âm tính.
Lựa chọn cách đóng gói có tính ổn định cao hơn.
Xây dựng hướng dẫn sử dụng bộ sinh phẩm
Xây dựng hướng dẫn sử dụng cho bộ sinh phẩm bao gồm: Cấu thành sản phẩm (bao gồm những thành phần nào); Hướng dẫn xử lý mẫu trước khi xét nghiệm; Quy trình xét nghiệm; Diễn giải kết quả.
Kiểm tra chất lượng bộ sinh phẩm và hoàn thiện sản phẩm
Với mỗi lô sản xuất lấy một lượng từ 5-10 hỗn hợp phản ứng PCR; các loại chứng để kiểm tra đánh giá chất lượng.
Sau khi kiểm tra chất lượng đạt tiêu chuẩn, các thành phẩn của bộ kit sẽ được đóng gói cho 100 phản ứng, dán nhãn và bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 20oC.
2.3.3.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm
- Chuẩn bị mẫu để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu
Chuẩn bị ban đầu
Lấy 03 mẫu đã cấy chuyển từ mẫu nấm chuẩn C. neoformans ATCC® 90113 và 51 chủng nấm C. neoformansphân lập từ dịch não tủy tại Việt Nam (danh sách theo phụ lục 2) sau khi được nuôi cấy xong sẽ lấy 2-3 khuẩn lạc cho vào dung dịch nước muối sinh lý rồi trộn đều tạo dịch treo. Đo độ đục của dịch treo để xác định mật độ nấm trong 1 ml; thêm dung dịch NaCl 0,9% để hiệu chỉnh về độ đục về 0,5 McFarland (tương đương 1-5 x 10
Chuẩn bị mẫu chuẩn dương
Chọn 02 mẫu nấm chuẩn C. neoformans ATCC® 90113 và 13 chủng nấm C. neoformans phân lập từ dịch não tủy tại Việt Nam đã được hiệu chuẩn về nồng độ 1-5 x 106CFU/ml.
Tiếp tục pha loãng các dịch treo trên bằng dung dịch NaCl 0,9% theo cấp số nhân để tạo các dung dịch có nồng độ từ 106CFU/ml xuống 102CFU/ml (ngưỡng phát hiện đã được xác định ở phần trước).
Sử dụng 02 nồng độ: Nồng độ cao 105CFU/ml và nồng độ thấp 102CFU/ml sử dụng bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm.
Tổng cộng có 30 mẫu chuẩn dương (15 mẫu x 2 nồng độ) được sử dụng để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu.
Chuẩn bị mẫu dịch não tủy giả định
+ Chọn mẫu nấm chuẩn C. neoformans ATCC® 90113 đã được hiệu chuẩn về nồng độ 1-5 x 106CFU/ml và 20 mẫu DNT không nhiễm nấm
C.neoformans.
+ Pha loãng mẫu nấm chuẩn vào 20 mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm C. neoformans
+ Tiếp tục pha loãng các dịch treo trên bằng dịch não tủy không nhiễm nấm để tạo ra các mẫu dịch não tủy giả định có nồng độ nấm C. neoformans
giảm dần theo cấp số nhân 105CFU/ml, 104CFU/ml, 103CFU/ml và 102CFU/ml.
Sử dụng 02 nồng độ: Nồng độ cao 105CFU/ml và nồng độ thấp 102CFU/ml thư nghiệm với bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm. Mỗi nồng độ thử nghiệm 2 lần.
Như vậy với 20 mẫu dịch não tủy gây nhiễm giả định, thử nghiệm 2 nồng độ, mỗi nồng độ lặp lại 2 lần, tổng có 80 mẫu.
Chuẩn bị mẫu chứng âm
Chọn 20 mẫu chuẩn âm để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật trong đó có 10 mẫu chuẩn âm là nước muối sinh lý (dung dịch để pha loãng mẫu chuẩn) và 10 mẫu là dịch não tủy đã được kiểm tra lại bằng bộ sinh phẩm Norgen khẳng định khơng có nấm C. neoformans (nền mẫu để chẩn đốn trên các mẫu lâm sàng).
Chuẩn bị mẫu lâm sàng
120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não thu thập ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch.
- Thực hiện kỹ thuật nested – PCR để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ
tương đồng với các kỹ thuật xét nghiệm khác
Thực hiện kỹ thuật PCR bằng bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 theo hướng dẫn. Để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các nền mẫu đã được chuẩn bị ở phần trên và theo sơ đồ nghiên cứu bao gồm 4 nền mẫu khác nhau: Mẫu chuẩn, mẫu DNT nhiễm giả định, mẫu dương tính với ni cấy từ mẫu lâm sàng và mẫu lâm sàng trực tiếp. Thực hiện phản ứng nested PCR ghi lại số lượng mẫu âm tính và dương tính trong q trình thực hiện. Tính tốn độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm theo mục 2.5 phần tính độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm.
+ Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn
Tiến hành kỹ thuật nested-PCR đối với 100 mẫu bao gồm: 15 mẫu chuẩn dương như đã chuẩn bị ở trên, mỗi mẫu 2 nồng độ là 105CFU/ml và nồng độ thấp 102CFU/ml) và 20 mẫu chuẩn âm – mỗi mẫu lặp lại 2 lần.
+ Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu DNT nhiễm giả định
Tiến hành kỹ thuật nested-PCR đối với 40 mẫu dịch não tủy (20 mẫu x 2 nồng độ) và 20 mẫu chuẩn âm – mỗi mẫu lặp lại 2 lần. Tổng có 80 mẫu giả định và 40 mẫu chuẩn âm.
+ Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu C. neoformans phân lập từ DNT tại Việt Nam
Tiến hành kỹ thuật nested-PCR đối với 51 chủng nấm C. neoformans
phân lập từ dịch não tủy tại Việt Nam – khơng pha lỗng nồng độ và 10 mẫu chứng âm (5 nước muối sinh lý, 5 mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm) - mỗi mẫu lặp lại 2 lần. Vậy tổng thử nghiệm 102 mẫu nhiễm C. neoformans và 20 mẫu chuẩn âm.
+ Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu lâm sàng
120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có biểu hiện viêm màng não thu ơ Bệnh viện Quân Y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch tiến hành đồng thời 2 xét nghiệm là nuôi cấy và kỹ thuật nested-PCR cùng 20 mẫu chứng âm để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu. Phương pháp tính độ nhạy và độ đặc hiệu được tính theo cơng thức ở mục 2.5.
- Đánh giá độ ổn định của bộ sinh phẩm
Lựa chọn 06 bộ sinh phẩm, cùng lơ sản xuất để đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm, các bộ sinh phẩm được bảo quản ở các điều kiện khác nhau (-200C; - 350C và – 800C). Hoạt động đánh giá được tiến hành ngay sau khi sản xuất và lặp lại hàng tháng, mỗi tháng 1 lần đến khi độ ổn định hạ xuống dưới 90% thì lặp lại 2 lần liên tiếp để khẳng định hoặc tối thiểu 12 tháng.
Đánh giá tính ổn định trên 10 mẫu chuẩn dương và 10 mẫu chuẩn âm (5 mẫu nước muối sinh lý và 5 mẫu dịch não tủy): các mẫu này được tách chiết ADN và bảo quản ở - 200C ; - 350C; – 800C và 03 tháng một lần mang ra thử nghiệm.
- Đánh giá tính tương đồng của bộ sinh phẩm
Tính tương đồng của bộ sinh phẩm được thực hiện trên các mẫu lâm sàng được thu tại BV Phạm Ngọc Thạch và BV Quân Y 103 bao gồm 120 mẫu dịch não tủy có triệu chứng lâm sàng và 20 mẫu chứng âm.
Trên 1 mẫu tiến hành đồng thời 3 phương pháp chẩn đoán bao gồm: Soi tươi nhuộm mực tầu, bộ sinh phẩm nested-PCR tự xây dựng và bộ sinh phẩm nested-PCR của Norgen. Ghi lại kết quả xét nghiệm và tính tốn độ tương đồng của các kỹ thuật dựa vào hệ số Kappa theo mục 2.5.