Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa các bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác
1.3.1. Thiết kế và chuẩn hóa nồng độ mồi cho phản ứng PCR
1.3.1.1. Thiết kế mồi cho phản ứng PCR
Mồi (Primers) có thể được coi là một trong những thành phần quan trọng nhất của phản ứng PCR và là một trong những yếu tố được quan tâm đầu tiên khi phát triển một kỹ thuật PCR mới. Mồi là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của sản phẩm PCR, nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi ADN đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà khơng thể bắt cặp được trên các chuỗi ADN khác ngồi chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu. Do đó,việc thiết kế mồi phải được tiến hành thật chính xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ đặc hiệu của phản ứng PCR.
Việc lựa chọn hoặc thiết kế mồi cần đảm bảo các yêu cầu sau: - Độ dài tối ưu của mồi từ 18-24 bazơ nitơ hay nucleotide;
- Tỷ lệ G + C chiếm 35-65%; - Tránh các nucleotide lặp lại;
- Cặp mồi phải có nhiệt độ nóng chảy (melting Temperatures - Tm) tương tự nhau, không chênh quá 50C. Nhiệt độ bám mồi được tính theo cơng thức Wallace như sau:
Tm = 40C x (G + C) + 20C x (A + T)
Thơng thường nhiệt độ nóng chảy thường ở khoảng 550C ± 80C.
- Nhiệt độ bám mồi (amplification Temperatures – Ta) được tính dựa vào nhiệt độ nóng chảy của mồi. Nhiệt độ bám mồi thấp có thể dẫn đến lượng sản phẩm PCR được tạo ra thấp, do không đủ số lượng lai giữa mồi và khuôn. Ngược lại, sản phẩm không đặc hiệu sẽ được tạo ra nhiều nếu nhiệt độ gắn mồi quá thấp. Người ta thường tính nhiệt độ gắn mồi theo cơng thức sau: Ta = 0.3 x Tm (Mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14,9
- Hiện tượng kết cặp (dimer): Là hiện tương mồi thay vì gắn vào khn sẽ gắn vào mồi ngược với nó hoặc với chính nó, tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ và làm giảm lượng mồi bắt cặp với khuôn.
- Cấu trúc kẹp tóc: có thể được hình thành bởi sự tương tác bên trong chính đoạn mồi làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR.
- Hiện tượng lặp lại nhiều lần trong trình tự mồi ví dụ: trình tự đơi như ATATATATAT hoặc đơn như GGGGG. Điều này có thể gây bắt cặp nhầm do đó số lần lặp tối đa của một mồi là 4 lần lặp cho cả hai trường hợp.
- Tương đồng chéo: Là hiện tượng mà cặp mồi sẽ khuếch đại một gen khác có trong hỗn hợp ban đầu. Để tránh hiện tượng này, mồi sau khi thiết kế cần được đưa lên BLAST để so sánh và kiểm tra độ đặc hiệu.
Mồi có thể tự thiết kế mồi bằng cách tìm các đoạn trình tự đặc hiệu cho lồi hoặc giống dựa trên các đoạn trình tự trên ngân hàng gen bằng cách gióng hàng hoặc sử dụng các phần mền chuyên dụng như Primer 3 để thiết kế. Hoặc có thể lựa chọn các cặp mồi do các tác giả trước đã sử dụng và kiểm tra xác định lại giá trị sử dụng của cặp mồi với các mẫu lâm sàng trong điều kiện thực tế của phịng thí nghiệm của đơn vị.
Đối với phản ứng PCR lồng cần chú ý việc thiết kế mồi của phản ứng PCR 2 phải nằm trong vùng trình tự ADN được khuếch đại từ phản ứng PCR1 [70],[71].
1.3.1.2. Chuẩn hóa nồng độ mồi của phản ứng PCR
Mồi sau khi được tổng hợp, thường được bảo quản ở dạng đơng khơ, sau đó có thể được hịa tan để sử dụng trong dung dịch 10mM Tris-HCl pH = 8; TE (10mM Tris-HCl pH = 8), 1 mM EDTA hoặc trong nước tinh khiết.
Tối ưu nồng độ mồi trong PCR cũng đóng vai trị rất quan trọng trong phản ứng PCR. Nếu nồng độ mồi quá cao, sẽ làm tăng khả năng liên kết không đặc hiệu hoặc thậm chí bắt cặp lẫn nhau. Thơng thường, nồng độ mồi
tổng số thường ở mức 0,1 - 1 µM. Để tăng độ đặc hiệu, có thể giảm xuống thấp ở mức 0,1 µM, tuy nhiên điều này có thể làm giảm hiệu suất PCR.
Dung dịch mồi gốc có nồng độ 1 mM có thể bảo quản ở nhiệt độ - 200C trong vòng 1 năm. Dung dịch mồi để thực hiện phản ứng có nồng độ thơng thường từ 25-100 µM cũng được bảo quản ở nhiệt độ này, và có thể rã đơng nhiều lần trong vịng 1 tháng mà khơng ảnh hưởng đến chất lượng mồi [70], [71].