Giếng 1: Sản phẩm PCR khi tiến hành 40 chu kỳ Giếng 2: Sản phẩm PCR khi tiến hành 25 chu kỳ; Giếng (-): Chứng âm
Giếng (M): Thang chuẩn 100 bp
Phản ứng PCR2 được lặp lại nhiều lần đều cho kết quả dương tính rõ, ổn định và khơng cịn băng phụ ở nhiệt độ gắn mồi là 57oC và nồng độ Mg2+
là 2,0mM số chu kỳ nhiệt là 25.
Bảng 3.14. Điều kiện của phản ứng PCR2 với cặp mồi CN4 và CN5 TT Hóa chất tham gia phản ứng Nồng độ cuối cùng Thể tích (µl) TT Hóa chất tham gia phản ứng Nồng độ cuối cùng Thể tích (µl)
1 Nước khử ion Vừa đủ đến 25 10,5 2 Master mix 2X Có MgCl2 nồng độ 4 mM 1X 12,5 3 Mồi CrN410µM 0,2µM 0,5 4 Mồi CrN510µM 0,2µM 0,5 5 ADN khuôn sản phẩm PCR1 100pg 1,0 Tổng 25
Bảng 3.15. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR2
Bước phản ứng Nhiệt độ 0C Thời gian Số chu kỳ
Tách sợi ban đầu 95 5 phút 01 Tách sợi 95 30 giây
Bám mồi 57 30 giây 25 Kéo dài mồi 72 45 giây
ổn định mồi 72 15 phút 01 Bảo quản sản phẩm PCR 4 ∞ 01
3.1.3.5. Xác định ngưỡng phát hiện và tính đặc hiệu của kỹ thuật nested-PCR
- Đánh giá ngưỡng phát hiện
Sử dụng ADN của chủng C. neoformans chuẩn pha lỗng đến nồng độ 1 ng/µl làm dung dịch chuẩn, sau đó pha lỗng tiếp theo thang 2, 5 và 10 tạo các dung dịch có nồng độ giảm dần. Các dung dịch thu được sẽ được tiến hành chạy PCR1 và PCR2 trong những điều kiện như nhau sau đó điện di để đánh giá ngưỡng phát hiện của kỹ thuật.