Stt Dạng đóng gói
Thời gian sau sản xuất
Kết quả sau thử nghiệm
Dạng kết quả Số lượng đúng/ tổng số 1 Dạng 1 Sau khi sản xuất Dương tính 20/20 2 Âm tính 10/10 3 Sau SX 01 tuần Dương tính 22/20 4 Âm tính 8/10 5 Sau SX 01 tháng Dương tính 23 6 Âm tính 7/10 7 Dạng 2 Sau khi sản xuất Dương tính 20/20 8 Âm tính 10/10 9 Sau SX 01 tuần Dương tính 20/20 10 Âm tính 10/10 11 Sau SX 01 tháng Dương tính 20/20 12 Âm tính 10/10
Qua bảng 3.24 nhận thấy dạng đóng gói 1 có tính ổn định kém hơn dạng đóng gói 02, sau 01 tuần sau khi sản xuất đã xuất hiện hiện tượng dương tính giả. Do đó chúng tơi quyết định lựa chọn bộ sinh phẩm số 02 để sản xuất hàng loạt.
Thành phẩn của bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm C. neoformans
Bảng 3.25. Thành phần bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm
C.neoformans
TT Tên dung dịch Bản chất Số lượng Thể tích/ống (µl)
1 Dung dịch MC-CR1 Master mix 02 ống 1012 2 Dung dịch MC-CR2 Master mix 01 ống 720 3 Dung dịch CR1 Master mix 02 ống 1012 4 Dung dịch CR2 Master mix 01 ống 840 5 Dung dịch M100 Marker 100bp 01 ống 200 6 Dung dịch LD100 Loading dye 01 ống 200 7 Chứng dương ADN nấm
C.neoformans
01 ống 200
8 Chứng âm ADN người 01 ống 200 9 Hướng dẫn sử dụng 01 tờ
Bộ sinh phẩm được đóng gói gồm 08 thành phần với 10 ống hóa chất kèm theo một bản hướng dẫn sử dụng bằng tiếng Việt (Phụ lục).
Ngồi hộp gồm có nhãn hộp có đầy đủ thơng tin về lơ sản xuất, ngày hết hạn, điều kiện bảo quản, nơi sản xuất như sau
- Lô D151201 -Ngày sản xuất 2016-12-15 - SL 100 phản ứng
- Ký hiệu DNT-C.neoformans RUO-Sửdụng Dùng thử nghiệm
- Nhiệt độ bảo quản -250C đến -150C - Đơn vị sản xuất Khoa Ký sinh trùng
Học viện quân y
Trên mỗi ống sinh phẩm đều có nhãn ghi đầy đủ thơng tin về lô sản xuất, hạn sử dụng, điều kiện bảo quản và thể tích thực (xem phụ lục).
3.2. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm
chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy
3.2.1. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm trong phịng thí nghiệm
3.2.1.1. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm trên các ADN mẫu chuẩn
Bảng 3.26. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên mẫu
C. neoformans chuẩn
Stt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR
Dương tính ((+)/tổng số)
Âm tính ((-)/tổng số) 1 Chuẩn dương ni cấy nồng độ 105CFU/ ml 30/30 0/30
2 Chuẩn dương nuôi cấy nồng độ 102CFU/ ml 30/30 0/30 3 Chuẩn âm NaCl 0,9% 0/20 20/20 4 Mẫu DNT không nhiễm C. neoformans 0/20 20/20 Tổng cộng 60/100 40/100
Qua kết quả ở bảng 3.26 nhận thấy với việc đánh giá 30 mẫu chuẩn dương, ở hai nồng độ khác nhau là nồng độ thấp 102CFU/ml và nồng độ cao 105CFU/ml; 20 mẫu chuẩn âm (10 chuẩn âm khơng có ADN là NaCl 0,9% và 10 chuẩn âm có ADN là dịch não tủy khơng có C. neoformans). Mỗi mẫu
chạy lặp lại 2 lần: 100% các mẫu chuẩn dương sản phẩm PCR xuất hiện băng kích thước 135 bp – đặc hiệu cho C. neoformans, 100% mẫu chuẩn âm khơng có sản phẩm PCR.
Bảng 3.27. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm
trên các mẫu chuẩn
Kết quả kit nested – PCR
Mẫu chuẩn (kiểm tra bằng nuôi cấy và bộ sinh phẩm Norgen)
Tổng số
Có C. neoformans Khơng có C. neoformans
Dương tính 60 0 60
Âm tính 0 40 40
Tổng số 60 40 100
Độ nhạy Se = 100%, Độ đặc hiệu Sp = 100%
Kết quả bảng 3.27 cho thấy bộ sinh phẩm nested PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy khi thử nghiệm với các mẫu
nấm C. neoformans của chủng chuẩn và mẫu chuẩn âm có độ nhạy, độ đặc hiệu đều là 100%.
- Kết quả đánh giá độ ổn định của bộ sinh phẩm
Bảng 3.28. Kết quả đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm Loại mẫu thử Thời gian Loại mẫu thử Thời gian
sau sản xuất
Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm nested-PCR Bảo quản -200C (+/TS) Bảo quản -350C (+/TS) Bảo quản -800C (+/TS)
1 Mẫu dương tính Ngay sau khi SX
10/10
Mẫu âm tính 0/10
2 Mẫu dương tính 3 Tháng sau SX
10/10 10/10 10/10 Mẫu âm tính 0/10 0/10 0/10 3 Mẫu dương tính 6 Tháng sau
SX
10/10 10/10 10/10 Mẫu âm tính 0/10 0/10 0/10 4 Mẫu dương tính 9 Tháng sau
SX 10/10 10/10 10/10 Mẫu âm tính 0/10 0/10 0/10 5 Mẫu dương tính 12 Tháng sau SX 10/10 10/10 10/10 Mẫu âm tính 0/10 0/10 0/10 Qua bảng 3.28 thấy rằng ở cả ba điều kiện bảo quản bộ sinh phẩm nested-PCR phát hiện nấm C. neoformans trong dịch não tủy ở nhiệt độ -
3.2.2.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu DNT nhiễm C. neoformans giả định
Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR trên các mẫu dịch não tủy giả định được thể hiện ở bảng 3.29
Bảng 3.29. Kết quả phản ứng nested PCR với các mẫu DNT giả định tt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR tt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR
Dương tính ((+)/tổng số) Âm tính ((-)/tổng số) 1 DNT giả định nồng độ 105CFU/ ml 40/40 0/40 2 DNT giả định nồng độ 102CFU/ ml 34/40 6/40 3 NaCl 0,9% 0/20 20/20 4 DNT không nấm C. neoformans 0/20 20/20 Tổng cộng 74/120 46/120
Kết quả bảng 3.29 cho thấy pha loãng các mẫu dịch não tủy gây nhiễm nấm C. neoformans giả định ở các nồng độ khác nhau rồi chọn 40 mẫu nồng độ thấp 102CFU/ml và nồng độ cao 105CFU/ml; 20 mẫu chuẩn âm (10 chuẩn âm khơng có ADN hay chuẩn trắng NaCl 0,9% và 10 chuẩn âm có ADN – dịch não tủy khơng có C. neoformans). Thử nghiệm với bộ sinh phẩm nested- PCR #A011-02 kết cho thấy với mẫu nhiễm giả định nồng độ cao 105CFU/ml 40 mẫu dương tính chiếm 100%; với mẫu nhiễm nấm giả định nồng độ thấp 102CFU/ ml có 34/40 mẫu dương tính chiếm 85%, 6/40 mẫu âm tính chiếm 15%; 100% mẫu khơng nhiễm nấm có kết quả âm tính.
Bảng 3.30. Kết quả đánh giá của trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ 105CFU/ ml Kết quả kit Nested – PCR Mẫu chuẩn Tổng số Có C. neoformans Khơng có C. neoformans Dương tính 40 0 40 Âm tính 0 40 40 Tổng số 40 40 80 Độ nhạy Se = 100% Độ đặc hiệu Sp = 100%
Qua bảng 3.30 nhận thấy khi gây nhiễm giả định trên dịch não tủy với nồng độ cao thì độ nhạy và độ đặc hiệu vẫn đảm bảo 100%.
Bảng 3.31. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các
mẫu nhiễm giả định nồng độ 102CFU/ ml
Kết quả kit Nested – PCR Mâu chuẩn Tổng số Có C. neoformans Khơng có C. neoformans Dương tính 34 0 34 Âm tính 6 40 46 Tổng số 40 40 80 Độ nhạy Se = 85% Độ đặc hiệu Sp = 100%
Bảng 3.31 là kết quả khi gây nhiễm với nồng độ thấp102CFU/ ml xấp xỉ ngưỡng phát hiện thì độ nhạy giảm đi rõ chỉ là 85%.
Bảng 3.32. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ từ 102CFU/ ml trở lên
Kết quả kit Nested – PCR
Mẫu chuẩn Tổng số
Có C. neoformans Khơng có C. neoformans
Dương tính 74 0 74
Âm tính 6 40 46
Tổng số 80 40 120
Độ nhạy Se = 92,5% Độ đặc hiệu Sp = 100%
Với các mẫu nhiễm giả định từ ngưỡng phát hiện trở lên bộ sinh phẩm nested-PCR có độ nhạy 92.5%, độ đặc hiệu 100%. Giá trị tiên đoán dương 100%, giá trị tiên đoán âm 87% với độ tin cậy 95%.
3.2.2. Kết quả đánh giá của bộ sinh phẩm trong các mẫu dịch não tủy lâm sàng
3.2.2.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu C. neoformans phân lập ở Việt Nam
Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR trên 51 mẫu ni cấy có mật độ nấm khác nhau.
Bằng bộ sinh phẩm nested-PCR tạo ra, tiến hàng chạy lại với toàn bộ 51 mẫu ADN của 51 chủng nấm C. neoformans khác nhau phân lập ở Việt Nam, mỗi chủng chạy 2 mẫu. Kết quả cho thấy 100% sản phẩm PCR2 sau khi điện di đều xuất hiện các băng có kích thước 135 bp. Kết quả này phù hợp với nấm
Bảng 3.33. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các chủng C.neoformans
phân lập ở Việt Nam
Stt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR
Dương tính ((+)/tổng số) Âm tính ((-)/tổng số) 1 C.neoformans phân lập ở Việt Nam 102/102 0/102 5 NaCl 0,9% 0/20 20/20 6 Mẫu dịch não tủy 0/20 20/20 Tổng cộng 102/142 40/142
Hình 3.17. Kết quả khuếch đại gen đích của nấm C. neoformans
bằng kỹ thuật nested-PCR
Trong hình giếng 1: Chứng âm; giếng 2: chứng dương; Các giếng 3-10: các mẫu ADN thử nghiệm; giếng 11: thang ADN chuẩn loại 100bp.
Bảng 3.34. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các
chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam
Kết quả kit nested – PCR
C.neoformans phân lập ở VN Tổng số
Có C. neoformans Khơng có C. neoformans
Dương tính 102 0 102
Âm tính 0 40 40
Tổng số 102 40 142
Độ nhạy Se = 100% Độ đặc hiệu Sp = 100%
Qua kết quả ở bảng trên nhận thấy với việc đánh giá trực tiếp trên 51 mẫu nuôi cấy và 20 mẫu chuẩn âm (10 chuẩn âm khơng có ADN hay chuẩn trắng NaCl 0,9% và 10 chuẩn âm có ADN – dịch não tủy khơng có C. neoformans). Bộ sinh phẩm nested – PCR #011 – 02 có độ nhạy và độ đặc
hiệu đều đạt 100%.
3.2.2.2. Kết quả đánh giá độ tương đồng của bộ sinh phẩm trên mẫu DNT bệnh nhân viêm màng não
Kết quả xét nghiệm bằng các phương pháp khác nhau trên các mẫu dịch não tủy bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng viêm màng não được thể hiện ở bảng 3.35.
Bảng 3.35. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các mẫu DNT của bệnh
nhân có triệu chứng lâm sàng VMN
Stt Loại mẫu thực hiện Phương pháp xét nghiệm
Soi tươi nhuộm mực tàu (+/TS) Nuôi cấy (+/TS) Nested- PCR (+/TS) Kit Norgen (+/TS) 1 DNT thu thập tại BV Phạm Ngọc Thạch 5/100 6/100 5/100 5/100 2 DNT thu thập tại BV Quân Y 103 2/20 2/20 2/20 2/20 Tổng cộng 7/120 8/120 7/120 7/120 Kết quả ở bảng trên cho thấy khi xét nghiệm dịch não tủy của 120 bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng viêm màng nào thì có 8/120 mẫu dịch não tủy dương tính với C. neoformans bằng phương pháp nuôi cấy (chiếm 6,67%),
trong đó có 7 mẫu cùng dương tính với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu, bộ sinh phẩm nested –PCR #011 – 02 và bộ sinh phẩm của Norgen.
- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu với phương pháp nuôi cấy trên các mẫu
lâm sàng
Bảng 3.36. Độ nhạy, độ đặc hiệu so với phương pháp nuôi cấy
Kết quả kit nested – PCR
Phương pháp ni cấy Tổng số Dương tính Âm tính
Dương tính 7 0 7
Âm tính 1 112 113
Tổng số 8 112 120
Độ nhạy Se = 87,5% Độ đặc hiệu Sp = 100% Giá trị tiên đoán dương: 100%
So sánh kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR với phương pháp nuôi cấy độ nhạy 87,5%; độ đặc hiệu 100%. Giá trị tiên đoán dương là 100% và giá trị tiên đoán âm là 99,1%. Trong thử nghiệm có 01 mẫu dương tính với ni cấy mà âm tính với các phương pháp xét nghiệm khác. Có thể mẫu này ngoại nhiễm với C. neoformans.
- Đánh giá độ tương đồng với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu
Bảng 3.37. Độ tương đồng so với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu Kết quả kit
nested – PCR
Phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu Tổng số Dương tính Âm tính Dương tính 5 2 7 Âm tính 2 111 113 Tổng số 7 113 120 Tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 96,7%
Tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0% K = 0,697
So sánh kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu cho thấy tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 96,7%, tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0%. Hệ số tương đồng giữa 2 phương pháp xét nghiệm là 0,697 (bảng 3.37).
- Đánh giá độ tương đồng với bộ sinh phẩm của Norgen
Bảng 3.38. Độ tương đồng so với bộ sinh phẩm của Norgen Kết quả kit nested – PCR Bộ sinh phẩm Norgen Tổng số Dương tính Âm tính Dương tính 7 0 7 Âm tính 0 113 113 Tổng số 7 113 120 Tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 100%
Tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0% K = 1
So sánh kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR với bộ sinh phẩm Norgen tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 100%, tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0%. Hệ số tương đồng giữa 2 phương pháp xét nghiệm là 1 hoàn toàn tương đồng.
3.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định chất lượng bộ sinh phẩm chế tạo ra
3.2.3.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở
Dựa trên kết quả nghiên cứu về độ nhay, độ đặc hiệu, độ ổn định của phương pháp cũng như quy trình kỹ thuật nested – PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ sinh phẩm.
Bảng 3.39. Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở TT Chỉ tiêu đánh giá Tiêu chuẩn cơ sở
1 Nhận dạng Phản ứng PCR2 cho bang kích thước 135 bp đặc trưng cho nấm C.neoformans
2 Độ nhạy ≥ 95% 3 Độ đặc hiệu ≥ 99% 4 Ngưỡng phát hiện ≥ 10pg/µl
5 Thời gian phát hiện Không quá 48 giờ 6 Độ ổn định ≥ 12 tháng
3.2.3.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR tại Viện kiểm định quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế
Viện kiểm định quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế có giấy chứng nhận kết quả kiểm định số 00515/SPCD-NC kết luận bộ sinh phẩm chẩn đoán nested-PCR phát hiện nấm C. neoformans loạt số #A011-02 do Học viện quân y sản xuất có độ nhạy đạt 98,11%; độ đặc hiệu 100%; ngưỡng phát hiện 0,4pg/µl khi thực hiện trên bộ mẫu chuẩn của nhà sản xuất.
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Về kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-
PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans
4.1.1. Bàn luận về kết quả giám định loài vi nấm C. neoformans để sử
dụng cho nghiên cứu xây dựng quy trình
Nghiên cứu này đã sử dụng 01 chủng nấm chuẩn mã số ATCC® 90113 đây là chủng C. neoformans var brutii được thu thập từ mẫu dịch não tủy tại Pensivalia đã được ngân hàng chủng chuẩn vi sinh vật Hoa Kỳ phân lập, giải trình tự và miêu tả các thuộc tính một cách đầy đủ.
Bảng 3.1 cho thấy để phục vụ cho nghiên cứu trong năm 2013 chúng tôi đã tiến hành thu thập 270 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng viêm màng não từ 04 bệnh viện của Việt Nam, gồm 143 mẫu từ bệnh viện Phạm Ngọc Thạch; 04 mẫu từ Bệnh viện quân Y 103; 20 mẫu từ Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương; 99 mẫu từ Bệnh viện Chợ Rẫy. Bằng phương pháp nuôi cấy trên thạch Sabouraud đã xác định có 51 mẫu dịch não tủy nhiễm nấm C. neoformans chiếm 18,89%. Sau đó 51 chủng C. neoformans này được định loài lại bằng sinh học phân tử, kết quả cho thấy cả
51 mẫu đều cho kết quả là C. neoformans. Điều này cho thấy tỉ lệ viêm màng não do nấm C. neoformans chiếm khá cao, tương đồng với nghiên cứu tại