Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans
1.2.3. Chẩn đoán bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Trong hai thập kỷ qua, vô số kỹ thuật phân tử đã được khám phá để phát hiện nấm gây bệnh. Nhiều kỹ thuật này, so với các kỹ thuật cổ điển, độ nhạy và độ đặc hiệu cao xác định đặc điểm của phức hệ loài C. neoformans [41].
Sinh học phân tử là một trong những cơng cụ chẩn đốn bệnh với độ nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian chẩn đoán nhanh. Các kỹ thuật này có tính đặc hiệu cao do việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho từng đối tượng nghiên
cứu và có độ nhạy cao vì chỉ cần một lượng rất nhỏ (vài picrogam) ADN cũng có thể cho kết quả chẩn đoán.
1.2.3.1. Kỹ thuật PCR cơ bản (conventinal PCR)
Mitchell và cs (1994) là những người đầu tiên sử dụng kỹ thuật PCR để định loại nấm C.neoformans [42]. Prariayachatigul và cs (1996) đã sử dụng kỹ thuật PCR để định loại nấm này dựa trên trình tự gen đích 18S với ngưỡng phát hiện 5 tế bào/mL dịch não tủy [43]. Mirhendi và cs (2001), đã sử dụng kỹ thuật này để phát hiện nấm C.neoformans dựa trên cơ sở gen CAP59 [44]. Paschoal và cs (2004) sử dụng kỹ thuật này để xác định nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy. So với nuôi cấy và soi tươi nhuộm mực tàu, kỹ thuật này có độ nhạy nhất (92,9% so với 85,7% và 76,8%) [45]. Một số sử dụng kỹ thuật này với các cặp mồi đặc hiệu để xác định các serotype hay genotype của nấm C.neoformans [46].
Kỹ thuật này dễ thực hiện, nhanh nhưng cũng có những nhược điểm nhất định như chỉ phát hiện được một nầm bệnh cùng lúc, nồng độ giới hạn phát hiện cao hơn so với các kỹ thuật PCR lồng (nested PCR)… Những trình tự gen đích thường được sử dụng để xây dựng cặp mồi là: URA 5, CAP59, ITS, 18S, 5.8S, 28S [39].
1.2.3.2. Kỹ thuật PCR lồng (còn gọi là PCR tổ, nested-PCR, PCR hai vòng)
Trong PCR lồng có hai cặp mồi được thiết kế cho 2 lần phản ứng. Sản phẩm khuếch đại của lần phản ứng thứ nhất (PCR1) sẽ được dùng làm khuôn cho lần phản ứng thứ 2 (PCR2) [47], [48]. Với cách thiết kế các cặp mồi, sản phẩm sau 2 lần phản ứng là rất đặc hiệu cho một loại mầm bệnh. Ngoài ra, do thực hiện hai lần khuếch đại gen nên số lượng đoạn DNA tạo ra sau khi kết thúc phản ứng thứ hai lớn hơn nhiều so với PCR thường. Chính vì vậy, độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật nested-PCR rất cao, có khi lên đến 100% [40], [48], [49].
Trong số các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR thì PCR lồng được sử dụng nhiều nhất để phân biệt C.neoformans và C. Gattii. Theo Shahindokht
Bassiri Jahromi (2006) và Paola Rappelli (1998) ngưỡng phát hiện nấm
C.neoformans trong dịch não tủy là trên 102 tế bào nấm/ml [48], [50].
Bên cạnh những ưu điểm, kỹ thuật nested-PCR có nhược điểm là chỉ xác định được duy nhất một loại mầm bệnh trong lần phân tích. Ngồi ra, do thực hiện hai lần chạy PCR để phân tích mẫu nên có thể có nguy cơ bị nhiễm trong các lần tạo hỗn hợp chạy PCR, điều này có thể dẫn tới dương tính giả... [48], [51].
1.2.3.3. Kỹ thuật PCR-RFLP (Đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn)
Kỹ thuật này được tiến hành với 2 bước. Bước 1 tiến hành phản ứng PCR, bước 2 cắt sản phẩm khuếch đại của phản ứng PCR bằng các enzyme giới hạn. Đối với việc xác định loài, cặp mồi thiết kế cho phản ứng PCR thường đại diện cho một giống, hoặc phân giống sinh vật do vậy chưa đủ cơ sở để xác định, phân biệt nhiều loài với nhau. Dựa vào sự khác biệt về trình tự nucleotite của các lồi khác nhau, sử dụng các enzymne giới hạn đặc hiệu để cắt sản phẩm PCR thành các đoạn có kích thước khác nhau, là cơ sở để phân biệt các loài... [44], [52]. SH Mirhendi và cs, (2001) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RFLP-PCR xác định, phân biệt một số nấm men Candida spp., nấm Aspergillus và nấm C.neoformans gây bệnh ở người, hoặc trong xác định các subtype, kiểu gen (genotype), kiểu huyết thanh (serotype) của nấm
C.neoformans … [44], [53].
Ở trong nước, một số tác giả đã ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác định nấm C.neoformans hoặc phân biệt C.neoformans với một số nấm men
phân lập từ người. Đỗ Ngọc Ánh và cs, (2015) áp dụng kỹ thuật này để xác định sự có mặt của nấm C. neoformans và Candida spp. trong dịch não tủy,
RFLP-PCR có độ nhạy 70%, độ đặc hiệu 97,5%. Chỉ số Kappa về mức độ phù hợp chẩn đốn so với ni cấy là 0,70 [54], [55].
Kỹ thuật này có nhược điểm là muốn nhìn rõ kết quả cắt giới hạn khi điện di thì sản phẩm PCR thu được phải nhiều. Trường hợp số lượng sản phẩm PCR ít (trên band điện di mờ) thì có thể khơng nhìn thấy sản phẩm cắt giới hạn khi chụp hình sản phẩm điện di. Ngồi ra, vị trí cắt giới hạn bằng enzyme có thể có biến đổi đa hình, xuất hiện một hoặc một vài nucleotide thay thế làm cho enzyme không cắt giới hạn được dẫn tới kết quả phân tích trở nên sai khác [44], [52], [56].
1.2.3.4. Kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex-PCR)
Đây là kỹ thuật sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại ADN nhằm phát hiện nhiều mầm bệnh trong một lần phản ứng. Kỹ thuật này có ưu điểm là giới hạn chẩn đoán nhanh, cùng lúc xác định được sự có mặt của một hoặc nhiều mầm bệnh [57], [58]. Tuy nhiên, việc thiết kế để có được cặp mồi có cùng nhiệt độ gắn mồi dùng cho PCR đa mồi khó. Có nhiều nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật này trong chẩn đốn vi nấm gây bệnh nói chung và các nấm Cryptococcus nói riêng [57], [58], [59]. Vivians và cs, (2007) sử dụng 2 phản ứng PCR để xác định trực tiếp 6 loại nấm gây bệnh từ môi trường nuôi cấy tăng sinh, trong đó có nấm C.neoformans. Tác giả này cho rằng, đây là kỹ
thuật có ưu điểm nhanh, đơn giản, tin cậy và có thể thay thế cho phương pháp định danh truyền thống bằng ni cấy, thử nghiệm sinh hóa. Leal AL và cs, (2008) đã ứng dụng kỹ thuật multiplex-PCR để xác định và phân biệt 2 loài C.
neoformans và C. gattii [59]. Theo Leal AL và cs, (2008) có 131 mẫu được phân tích bằng kỹ thuật multiplex-PCR phù hợp hồn tồn với kết quả định danh trước đó, trong khi phân biệt C.neoformans và C. gattii bằng mơi trường CGB có 6 chủng kết quả khơng phù hợp [59]. Như vậy, có thể nói Multiplex- PCR có nhiều ưu điểm rõ rệt so với các kỹ thuật truyền thống. Tuy nhiên, kỹ
thuật này cũng có một số nhược điểm đó là chi phí thực hiện cao và q trình xây dựng thiết lập quy trình kỹ thuật mất nhiều thời gian. Có sự cạnh tranh giữa các mồi với trình tự đích và các hóa chất có trong thành phần phản ứng. Ngồi ra, kỹ thuật này yêu cầu nghiêm ngặt kiểm soát sự tự bắt chéo giữa các mồi tạo ra các dương tính giả.
1.2.3.5. Kỹ thuật PCR lồng đa mồi (nested multiplex-PCR)
Kỹ thuật nested multiplex-PCR hay kỹ thuật khuếch gen lồng đa mồi là sự kết hợp của 2 kỹ thuật PCR lồng và PCR đa mồi. Ở phản ứng PCR thứ nhất (PCR1), 01 cặp mồi được thiết kế để khuếch đại được gen của cả 2 hay nhiều loài thuộc cùng nhóm mầm bệnh (mồi chung). Các cặp mồi ở phản ứng PCR thứ hai (PCR2) được thiết kế đặc hiệu cho từng mầm bệnh và khuếch đại đoạn gen nằm trong đoạn DNA được khuếch đại ở phản ứng PCR1 [60]. Kỹ thuật này đã được nghiên cứu phát triển trong phát hiện một số vi khuẩn, virut và vi nấm gây bệnh ở người như Đỗ Ngọc Ánh và cs (2017) đã thiết lập và xây dựng quy trình kỹ thuật nested multiplex-PCR để phát hiện đồng thời 2 nấm C. neoformans và C. albicans. Taira và cs (2014) sử dụng kỹ thuật này
để phát hiện một số nấm Candida gây bệnh nấm máu ở bệnh nhân nhi bị bệnh nặng [60]. Theo Nguyễn Trọng Chính và cs (2017), độ nhạy của kỹ thuật nested multiplex-PCR trong phát hiện C. neoformans và C. albicans ở dịch não tủy 77,78%, độ đặc hiệu 99,1% [61].
Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là nguy cơ bị nhiễm trong các lần tạo hỗn hợp chạy PCR rất cao, điều này dẫn tới dễ gây ra dương tính giả …[61].
1.2.3.6. Kỹ thuật PCR thời gian thực (real-time PCR)
Hiện nay, một trong những phương pháp tiên tiến nhất sử dụng để chẩn đoán các mầm bệnh là PCR thời gian thực (real-time PCR). Ở kỹ thuật này quá trình nhuộm màu phát hiện ADN được diễn ra đồng thời với phản ứng PCR [62]. Real-time PCR có độ nhạy cao hơn phản ứng PCR và thời gian thực hiện nhanh hơn. Đây là một trong những kỹ thuật hiện đại nhất áp dụng cho nghiên
cứu bệnh Cryptococcosis và các tác nhân gây bệnh khác. Ngồi ra, kỹ thuật này cịn cho phép đánh giá sự biểu hiện của các gen có liên quan đến độc tính vi sinh vật [62].
Trong một nghiên cứu so sánh, Bialek và cs, (2002) cho real-time PCR nhanh hơn PCR lồng để phát hiện nấm, đồng thời cung cấp được kết quả định lượng [63]. Eberling, (2011) đã phân biệt các mẫu Cryptococcus spp. và Candida spp. thu được từ các mẫu lâm sàng. Sử dụng PCR thời gian thực với
các mồi đặc hiệu cho loài và đã chứng minh rằng kỹ thuật này nhanh, nhạy và đặc hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh [64].
Gần đây, Real-time PCR cũng đã được sử dụng thành cơng để chẩn đốn xác nhận viêm màng ngồi tim do nấm C. neoformans, với trình tự gen
đích 18S và 28SrRNA [65]. Veron và cs, (2009); Satoh và cs, (2011) đã phát triển kỹ thuật PCR thời gian thực TaqMan để chẩn đốn cryptococcosis có độ nhạy và độ đặc hiệu cao [66], [67].
1.2.3.7. Một số bộ sinh phẩm chẩn đoán nấm C. neoformans
Ngày nay, ứng dụng rộng rãi các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán đang được nhiều quốc gia quan tâm [68]. Chính vì vậy việc tạo ra các bộ sinh phẩm để có thể áp dụng rộng rãi trong các cơ sở y tế đang là hướng đi mà nhiều quốc gia, doanh nghiệp nghiên cứu. Đối với chẩn đoán nấm C. neoformans, nhiều hãng nổi tiếng đã nghiên cứu thành công và thương mại
hóa. Các bộ kit chẩn đốn như GENEKAM Biotechnology AG, Norgen Biotek (Canada) sản xuất 1 loạt các bộ sinh phẩm realtime chẩn đoán C. neoformans
(bảng 1.2), hay bộ kit BlackLight® Fungal ID Kit phát hiện các một số loài nấm của hãng Blackbio (Tây Ban Nha), C.neoformans-EASY, Path- C.neoformans, Path-C.neoformans-standard phát hiện C. neoformans của hãng
Genesig (Anh); AmpliSens Cryptococcus neoformans-FRT; PCRmax Ltd
neoformans qPCR Kit của hãng Vivantis; Techne™ PrimePRO QPCR DNA
detection Kit Cryptococcus neoformans của hãng Fisher sicientific…
Bảng 1.2. Một số bộ sinh phẩm chẩn đoán C. neoformans của hãng Norgen
Biotek
Tên thương phẩm Mã số Số lượng
phản ứng
C. neoformans TaqMan PCR Kit TM42720 24
C. neoformans TaqMan Probe/Primer and Control Set TM42730 100
C. neoformans End-Point PCR Kit EP42720 24
C. neoformans Primer and Control Set EP42730 100 rxns