Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa các bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác
1.3.2. Chuẩn hóa các điều kiện của phản ứng PCR
1.3.2.1. Lựa chọn enzym polymerase
Enzyme Taq DNA polymease được sử dụng phổ biến cho phản ứng PCR. Enzyme Pyrococcus furiosus (PFU) polymerase ngày nay cũng được sử dụng phổ biến cho PCR có tỉ lệ sai sót thấp hơn so với enzyme Taq polymerase. Tuy nhiên, các enzyme khác nhau hoạt động ít nhiều hiệu quả đối với các khn khác nhau. Ví dụ, nếu vùng ADN khuôn quan tâm chứa hàm lượng G-C cao (trên 65%), thì enzyme Accuprime DNA polymerase giàu G-C sẽ là lựa chọn tốt hơn cho phản ứng PCR. Thông thường tùy vào loại phản ứng PCR và thể tích phản ứng lượng enzym polymerase thay đổi từ 0,5 đến 2,5 đơn vị cho một phản ứng [69], [72], [73].
1.3.2.2. Nồng độ của Mg2+ trong dung dịch đệm
Dung dịch đệm cho PCR là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng phản ứng PCR. Thành phần dung dịch đệm của phản ứng PCR phụ thuộc vào loại enzym ADN polymerase sử dụng trong PCR. Đệm PCR thường chứa muối Tris HCl 10 mM, KCl 50mM và MgCl2 1,5mM. Ngoài ra, đệm PCR cịn có thể chứa 0,001% BSA hay Gelatine và tween hay formamide.
Trong các thành phần trên, ảnh hưởng lên phản ứng PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl2, vì vậy để có được một thử nghiệm PCR có độ nhạy cao,
phản ứng rõ nét, người ta phải tối ưu hóa phản ứng bằng cách thăm dị một nồng độ MgCl2 thích hợp nhất.
Thơng thường nên sử dụng đúng loại dung dịch đệm tương ứng với enzyme do nhà sản xuất khuyến cáo. Nhiều loại dung dịch đệm đã có sẵn một lượng nhất định ion Mg2+ nên cần lưu ý khi tối ưu hóa nồng độ Mg2+.
Việc tăng nồng độ ion Mg2+ có thể làm xuất hiện thêm các sản phẩm khơng đặc hiệu, nếu thiếu ion Mg2+ thì dẫn đến lượng sản phẩm PCR thấp. Dị tìm nồng độ Mg2+ tối ưu thông thường bằng gradien nồng độ từ 0,75 đến 4 mM với các khoảng cách mỗi bước từ 0,2 đến 0,5 mM [70], [71].
1.3.2.3. Nồng độ dNTPs (deoxy nucleoside triphosphate)
Đây là thành phần để tổng hợp nên các bản sao trong phản ứng PCR. Có 4 loại dNTP dùng trong phản ứng PCR là Adenine (dATP), Thymine (dTTP), Cytosine (dCTP), Guanine (dGTP). dNTPs là loại hóa chất kém bền cần lưu ý khi sử dụng và bảo quản, nên chia nhỏ lượng dNTPs để giảm số lần làm tan, sử dụng lại. Nồng độ của dNTPs có thể ảnh hưởng tới cả độ đặc hiệu và năng suất của PCR. Nồng độ dNTP quá cao sẽ làm giảm độ đặc hiệu, trong khi quá thấp sẽ làm giảm hiệu suất. Nồng độ dNTP thông thường từ 50 µM đến 200µM.
1.3.2.4. ADN khn
Là ADN mẫu mà chúng ta sẽ khuếch đại: Có thể là ADN kép, đơn được tách chiết từ các đối tượng nghiên cứu. ADN khn cần có độ ngun vẹn cao tránh lẫn tạp chất.
Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi đoạn ADN cần khuếch đại không dài quá, khuếch đại tốt nhất với đoạn ADN dài khoảng 1-1,5kb.
Mẫu ADN tinh sạch sẽ cho kết quả tốt, sử dụng quá nhiều ADN làm giảm độ đặc hiệu phản ứng và làm tăng sự khuếch đại các sản phẩm không mong muốn. Do PCR rất nhạy, nên sử dụng mẫu ADN khn ít nhất có thể.
Bắt đầu với khơng q 1ng ADN khn từ plasmid, 10-40ng cho mẫu cDNA hoặc lên tới 1µg đối với các mẫu ADN tách từ mẫu lâm sàng.
Chú ý có một số hóa chất sử dụng trong quá trình tách chiết ADN như SDS hay protease có thể ức chế phản ứng PCR. Do đó nếu cần thiết nên tiến hành thêm bước tủa ADN bằng cồn để loại bỏ các chất ức chế. Thông thường nồng độ của ADN khn từ 0,1 – 1µg.
1.3.2.5. Thể tích của phản ứng
Với các thế hệ máy luân nhiệt mới, thể tích của một phản ứng PCR có thể thay đổi từ 5-100µl. Thể tích càng nhỏ sẽ khuếch đại lượng ADN khuôn nhỏ một cách hiệu quả hơn thể tích lớn. Thể tích thơng thường được sử dụng là từ 20 đến 50µl.
Thành phần của một phản ứng PCR thông thường với thể tích 50µl được thể hiện ở bảng 1.3.
Bảng 1.3. Thành phần phản ứng PCR thơng thường với thể tích 50 µl
Số TT Hóa chất Nồng độ hóa chất Thể tích cho 1 phản ứng
1 Nước khử Ion khử Ion Vừa đủ 50µl
2 Đệm PCR 10X 5µl 3 dNTPs 10mM 1µl 4 MgCl2 25mM 3µl 5 Mồi xi 20µM 1µl 6 Mồi ngược 20µM 1µl 7 ADN khn 0,1-1µg Tùy nồng độ 8 Taq Polymerase 5 đơn vị/µl 0,5µl
1.3.2.6. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
Chu kỳ nhiệt của phẩn ứng PCR thường bao gồm q trình tách ADN sợi đơi, 25- 40 chu kỳ khuếch đại phản ứng PCR bao gồm quá trình tách sợi, bám mồi, kéo dài mồi và cuối cùng là giai đoạn ồn định sản phẩm PCR. Chu kỳ của một phản ứng PCR thông thường được thể hiện ở bảng 1.4.
Bảng 1.4. Chu kỳ nhiệt của một phản ứng PCR thông thường STT Các bước của STT Các bước của
chu kỳ nhiệt
Chu kỳ 3 bước của phản ứng PCR Số chu kỳ
Nhiệt độ Thời gian
1 Tách sợi ban đầu 940C - 950C 2-10 phút 1
2 Tách sợi 940C 10 – 60 giây 25 - 40 chu kỳ 3 Bám mồi Thấp hơn 50C so với Tm thông thường 550C ± 100C 20 - 60 giây
4 Kéo dài mồi 700C - 800C Thông thường 720C
Phụ thuộc vào đoạn ADN cần khuếch đại và enzym Polymerase sử dụng 5 Ổn định sản phẩm PCR 700C Thông thường 720C - 800C 5 - 10 phút 1 chu kỳ 6 Bảo quản sản phẩm
40C Đến khi điện di 1 chu kỳ
- Thời gian tách sợi
với ADN khuôn từ hệ gen thời gian tách sợi thông thường khoảng 2 phút ở nhiệt độ 940C. Thời gian tách sợi ở các chu kỳ tiếp theo khoảng từ 20 đến 60 giây thay đổi phụ thuộc vào loại máy PCR, loại ống, kích thước ống phản ứng và nồng độ GC.
- Thời gian bám mồi
Nhiệt độ bám mồi đã được đề cập ở phần thiết kế mồi. Thông thường nhiệt độ bám mồi từ 520C đến 620C, thời gian bám mồi thường từ 20 đến 60 giây.
- Thời gian kéo dài mồi
Nhiệt độ kéo dài mồi thông thường được giữ ở 720C, thời gian kéo dài mồi từ 45 đến 60 giây cho mỗi kb. Đối với những sản phẩm PCR có kích thước lớn hơn 5 kb thì thời gian kéo dài mồi khoảng 2 phút. Thời gian ổn định mồi cuối cùng thường khoảng 5 đến 10 phút.