Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Mẫu nghiên cứu
2.3.2.1. Cỡ mẫu nghiên cứu
- Mẫu xây dựng quy trình kỹ thuật nested – PCR chẩn đốn nhiễm nấm C. neoformans
+ Chủng chuẩn C. neoformans mã số ATCC®90113: 01 chủng
+ C. neoformans được phân lập từ dịch não tủy ở Bệnh viện Quân y 103 và
bệnh viện Phạm Ngọc Thạch: 07 chủng
+ C. albicans: 02 chủng - 01 chuẩn ATCC®90028 và 01chủng Việt Nam; + Chủng C. tropicalis: 01 chủng Việt Nam;
+ Chủng C. krusei: 01 chủng Việt Nam; + Chủng C. parapsilosis: 01 chủng Việt Nam; + Chủng C. glabrata: 01 chủng Việt Nam;
Các chủng trên đã được giải trình tự và đăng ký trên genbank năm 2017
+ Các chủng vi khuẩn gây bệnh ở người có nguồn gốc ở Việt Nam: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa: Mỗi loài 01 chủng
- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm
+ 20 bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 do Học viện Quân Y sản xuất; + 01 chủng nấm C. neoformans chuẩn;
+ 20 mẫu dịch não tủy gây nhiễm giả định; + 10 mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm;
+ 51 chủng nấm C. neoformans được phân lập từ dịch não tủy người Việt Nam ở Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ rẫy và Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương;
+ 120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não thu thập ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch.
- Đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm
06 bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 do Học viện Quân Y sản xuất
2.3.2.2. Phương pháp chọn mẫu
+ Chủng mẫu chuẩn mua từ ATCC (American Type Culture Collection - Hệ thống Chủng chuẩn của Mỹ) ký hiệu là: ATCC® 90113 (C. neoformans) và ATCC®90028 (C. albicans)
+ Phân lập mẫu C. neoformans: Tại 04 bệnh viện là Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Quân y 103 sẽ thu thập dịch não tủy của tất cả những bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng viêm màng não từ 4/2013 đến 12/2013. Tất cả mẫu dịch não tủy này sẽ được soi tươi, nuôi cấy xác định C. neoformans. Các chủng C. neoformans sau đó sẽ được giám định lồi bằng sinh học phân tử trước khi đưa
vào sử dụng để xây dựng quy trình kỹ thuật nested – PCR. Một số chủng vi nấm đã được giải trình tự và đăng ký trên ngân hàng gen vào năm 2017 và 2018. + Mẫu làm chứng âm: Các chủng vi khuẩn và vi nấm sử dụng làm chứng âm đều được phân lập từ các bệnh nhân ở Việt Nam, định loại dựa vào các dấu hiệu hình thái điển hình; Định loại bằng sinh học phân tử theo các nghiên cứu đã được cơng bố trên các tạp chí Quốc tế.
+ Mẫu phục vụ cho thử nghiệm giả định: Mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm thu từ bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não hoặc nghi ngờ viêm màng não không do nấm C. neoformans (đã loại trừ bằng phương pháp soi tươi, nuôi cấy và chạy PCR bằng bộ sinh phẩm của Norgen) ở Bệnh viện Quân y 103;
+ Chọn mẫu để thử nghiệm bộ sinh phẩm ở thực địa: Dịch não tủy các bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não đến khám tại bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Quân y 103 trong giai đoạn 10/2015 đến 10/2017.