Bảng 3.16. Thử nghiệm đánh giá ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested-PCR STT Nồng độ ADN STT Nồng độ ADN ban đầu Tổng số lần xét nghiệm Kết quả phản ứng PCR Dương tính Âm tính 1 1 ng (1000 pg) 15 15 0 2 10-1 (100 pg) 15 15 0 3 10-2 (10 pg) 15 15 0 4 10-3 (1 pg) 15 8 7 5 10-4 (0,1 pg) 15 0 15 6 10-5 (0,01 pg) 15 0 15 Qua bảng 3.16 và hình 3.14 nhận thấy ở nồng độ 1pg 53,33% có sản phẩm PCR; từ 0,1pg trở xuống khơng có sản phẩm PCR; từ 10-2 ng (10 pg) trở lên 100% sản phẩm PCR xuất hiện băng 135bp. Như vậy ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested -PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong
dịch não tủy ở nghiên cứu này là 10pg/µl.
- Kết quả đánh giá kỹ thuật nested-PCR trên chủng nấm C. neoformans
thu thập từ mẫu lâm sàng tại Việt Nam
Tiến hành kỹ thuật nested – PCR với các điều kiện đã tối ưu với chủng nấm chuẩn ATCC® 90113 và 7 mẫu dịch não tủy đã được xác định có C. neoformans dương tính, có đặc điểm định loại hình thái điển hình. Kết quả xét
Bảng 3.17. Kết quả đánh giá kỹ thuật nested-PCR trên chủng nấm
C. neoformans thu thập từ mẫu lâm sàng tại Việt Nam
TT Ký hiê ̣u mẫu Vị trí phân lập Hình thái Nested PCR
1 ATCC® 90113 Chủng chuẩn, Mỹ Điển hình Băng đặc hiệu 135 bp 2 Vn_N17 Dịch não tủy Điển hình 135 bp
3 Vn_N41 Dịch não tủy Điển hình 135 bp 4 Vn_N57 Dịch não tủy Điển hình 135 bp 5 Vn_N58 Dịch não tủy Điển hình 135 bp 6 Vn_N61 Dịch não tủy Điển hình 135 bp 7 Vn_N117 Dịch não tủy Điển hình 135 bp 8 Vn_N132 Dịch não tủy Điển hình 135 bp
Bảng 3.17 nhận thấy sản phẩm PCR2 chạy với các điều kiện đã tối ưu của kỹ thuật nested PCR, sau khi điện di đều có băng 135 bp đặc hiệu của nấm
C. neoformans.
Chọn 02 mẫu N117 và N132 để giải trình tự kiểm tra tính đặc hiệu của sản phẩm trên ngân hàng gen.
a
b
Hình 3.15. Kết quả PCR2 các mẫu N117 và N132 a) Sản phẩm PCR2 các mẫu Vn_N117 và Vn_N132