Theo nghiên cứu của Nugent và cs (2005) đánh giá về vai trò của tỷ lệ hiện hiện mắc, độ nhạy và độ đặc hiệu trong đánh giá độ chính xác, Nishikawa và cs (2013) trong nghiên cứu ”ước tính độ nhạy, độ đặc hiệu để
đánh giá kỹ thuật dựa vào nghiên cứu quan sát” đã nêu rõ các định nghĩa: Độ nhạy (Se - sensitivity) [76], [74], [77], [78]: Của một xét nghiệm chẩn đốn là tỷ lệ người mang bệnh có kết quả xét nghiệm dương tính.
-Độ đặc hiệu (Sp - specificity)[74], [77], [78]: Của một xét nghiệm chẩn đốn là tỷ lệ người khơng mang bệnh có kết quả xét nghiệm âm tính.
Để xác định Se, Sp người ta so sánh kết quả chẩn đoán của phương pháp cần xác định với phương pháp chuẩn (được gọi là chuẩn vàng, gold standard) [74].
Phương pháp chuẩn là phương pháp được xem như độ chính xác cao (tuy nhiên khơng phải hồn tồn tuyệt đối), do đó việc xác định chuẩn vàng để đánh giá một xét nghiệm mới là vô cùng quan trọng.
Theo định nghĩa trên để đánh giá được độ nhạy, độ đặc hiệu của một sinh phẩm chuẩn đốn ngồi việc xác định được chuẩn vàng, thì mẫu được sử dụng để đánh giá xét nghiệm mang tính quyết định về tính chính xác của bộ sinh phẩm [77],[79].
Xác định mẫu dương tính thật (TP - true positive): hay cịn gọi là mẫu chuẩn dương –là các mẫu đã được xác định dương tính về mặt hình thái, đối với những nghiên cứu gần đây thì mẫu chuẩn dương phải được thẩm định lại bằng một kỹ thuật sinh học phân tử đã được công bố trên các tạp chí uy tín của thế giới hoặc lưu giữ trên ngân hàng gen (Nishikawa, Lakhen 2008).
Mẫu âm tính thật (TN – true negative) – thường là các nền mẫu giống như mẫu xét nghiệm nhưng không chứa tác nhân gây bệnh, hoặc mẫu chứng trắng (mẫu nước cất, hoặc dung mơi phù hợp hồn tồn khơng chứa tác nhân gây bệnh); Các mẫu âm tính thật cũng cần được thẩm định xác định hồn tồn khơng chứa tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
Sau đó để đánh giá khả năng áp dụng của bộ sinh phẩm này trên mẫu lâm sàng, yêu cầu phải đánh giá bộ sinh phẩm trên các mẫu lâm sàng thu từ thực địa. Đối với các mẫu lâm sàng khi xét nghiệm có thêm khái niệm:
Mẫu dương tính giả (FP - false poisitive): Mẫu âm tính nhưng vì một lý do nào đó khi xét nghiệm cho kết quả dương tính.
Mẫu âm tính giả (FP - false poisitive): Mẫu dương tính nhưng vì một lý do nào đó khi xét nghiệm cho kết quả âm tính.
Giá trị tiên đoán dương (PPV - positive predictive value): Là tỷ lệ người có kết quả xét nghiệm dương tính thật sự mang bệnh.
Giá trị tiên đoán âm (NPV - negative predictive value): Là tỷ lệ người có kết quả xét nghiệm âm tính thật sự khơng mang bệnh.
Xét nghiệm có độ nhạy cao sẽ cải thiện giá trị tiên đốn âm (ít kết quả âm tính giả).
Xét nghiệm có độ đặc hiệu cao giúp cải thiện giá trị tiên đốn dương (ít kết quả dương tính giả) [78], [79], [80].
Hetal và cs, (2011) khi đánh giá tính khả năng áp dụng của que thử nhanh để chẩn đoán viêm màng não tủy do nấm C. neoformans trên 63 mẫu
dịch não tủy bằng phương pháp nhuộm mực tàu; và nuôi cấy đã xác địnhđộ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp nhuộm mực tàu là 83,3% và 96,49%. Trong khi đó các giá trị này ở phương pháp Latex là 100% và 94,7% so với phương pháp chuẩn vàng là phương pháp nuôi cấy [81].
Binnicker và cs (2012) khi so sánh thử nghiệm để phát hiện nhiễm nấm Cryptococcus với 4 loại xét nghiệm miễm dịchvới nhau không so sánh với phương pháp nuôi cấy đã chỉ ra độ nhạy, độ đặc hiệu của các phương pháp có sự khác biệt. Thử nghiệm Media Latex có độ nhạy và độ đặc hiệu 100%; trong khi đó với thử nghiệm miễn dịch ban đầu Premier EIA có độ nhạy thấp hơn nhiều 55,6%, trong khi độ đặc hiệu vẫn là 100%; Thử nghiệm miễn dịch với kháng thể alpha CrAg có độ nhạy là 100% và độ đặc hiệu là 99,8% và thử nghiệm miễn dịch dòng chảy với kháng thể CrAg cũng có độ nhạy và độ đặc hiệu là 100% [82], [83].
Klauner, 2013 khi nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của thử nghiệm miễn dịch chảy phát hiện kháng nguyên nấm cryptoccuccus trong huyết thanh và dịch não tủy đã chỉ ra độ nhạy của phản ứng huyết thanh ở ngưỡng 100% và độ nhạy là 99,5 đối với huyết thanh và 100% và 97,7% trên dịch não tủy. Độ nhạy hay ngưỡng phát hiện của LFA so với LA hay ELISA có thể tăng gấp 200 lần [84].
Wang và cs (2015) khi đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp LA trên mẫu dịch não tủy của 112 bệnh nhân viêm màng não do nấm Cryptoccocus và 26 bệnh nhân lao màng não và viêm màng não do virus so với phương pháp nuôi cấy và soi trực tiếp chỉ ra độ nhạy của 3 phương pháp tương ứng là 91,1%; 69,6% và 73,2%. Độ đặc hiệu là 96,0%, 100% và 100%.
Shah và cs (2011), khi xét nghiệm trên 63 bệnh nhân HIV nghi ngờ viêm màng não do nấm dựa theo các chỉ số lâm sàng, đã xác định độ nhạy của phương pháp LA so với phương pháp nuôi cấy là 100%; độ đặc hiệu là 96,42%. Khi so sánh phương pháp LA với phương pháp nhuộm mực tàu soi tươi độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng là 85,7% và 100% [81].
Nghiên cứu của Rivera và cs (2015) khi chuẩn hóa và áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định nhiễm nấm C. neoformans và C. gatti trên 44 mẫu nhiễm lâm sàng đã được chấn đốn bằng kỹ thuật ni cấy; 51 mẫu chứng âm và 92 mẫu nhiễm các loài ký sinh trùng và vi nấm khác, cho thấy kỹ thuật được xây dựng có độ nhạy và độ đặc hiệu đều đạt 100% [49].
1.4.2. So sánh tính tương đồng của bộ sinh phẩm
So sánh tính tương đồng của bộ sinh phẩm chẩn đoán mới với chuẩn vàng, Trong trường hợp xác định nấm C. neoformans thì so sánh với phương pháp ni cấy và nhuộm mực tàu xác định hình thái. Và so sánh bộ sinh phẩm chẩn đoán mới với một kỹ thuật hoặc một bộ sinh phẩm có ngưỡng phát hiện tương đương, tùy từng trường hợp nếu đã có những bộ sinh phẩm có ngưỡng
phát hiện tương đương đã được thương mại hóa trên thị trường thì sử dụng bộ sinh phẩm đã được thương mại hóa.
Tính tương đồng của bộ sinh phẩm được tính bằng mức độ thống nhất giữa hai bộ sinh phẩm thể hiện qua hệ số kappa (K).
Trị số K biến động từ -1 (hoàn toàn trái ngược) qua điểm 0 (thống nhất do ngẫu nhiên mà thôi) đến +1 (thống nhất hồn tồn).
1.4.3. Đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm
Ngồi độ nhạy, độ đặc hiệu, tính tương đồng thì một đặc tính quan trọng để quyết định khả năng áp dụng của bộ sinh phẩm là tính ổn định của bộ sinh phẩm. Một bộ sinh phẩm sinh học phân tử, phải có thời hạn sử dụng tối thiểu trong vịng 6 tháng. Để đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm cần tiến hành bào quản bộ sinh phẩm trong các điều kiện khác nhau, và hàng tháng tiến hành thực hiện xét nghiệm trên các mẫu chuẩn, mà mẫu lâm sàng cố định đã được bảo quản trong các điểu kiện tối ưu đảm bảo không thay đổi bản chất của mẫu; đánh giá tối thiểu 6 tháng và càng lâu càng tốt, hoạt động đánh giá được dừng lại khi kết quả đánh giá 2 lần liên tiếp khơng đảm bảo tính ổn định.
1.4.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ sinh phẩm
Sau khi tiến hành q trình tối ưu hóa thành phần và chu trình phản ứng PCR, xây dựng được chứng dương, chứng âm chứng nội chuẩn, đánh giá được độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định của bộ sinh phẩm sẽ tiến hành tập hợp các số liệu để công bố tiêu chuẩn cơ sở của bộ sinh phẩm.
Với hai mục tiêu của để tài chúng tơi tiến hành chuẩn hóa kỹ thuật nested - PCR và đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm C. neoformans trong dịch não tủy theo các nguyên lý được nêu ra ở mục 1.3 và 1.4 của phần tổng quan tài liệu.