Giếng 1: Chứng âm; Giếng 2: chứng dương
Giếng 8: Thang chuẩn 50 bp
Giếng 9- giếng 13: Nồng độ ADN từ 0,001112đến 0,0001112 ng
3.1.3.2. Kết quả tạo dãy chứng chuẩn âm
Chứng chuẩn âm là dung dịch chứa ADN của người và của vi khuẩn, virus hoặc các vi nấm khác không phải là C.neoformans. Nồng độ ADN trong các dung dịch dao động từ 50 pg/µl đến 20 µg/µl.
Bảng 3.8. Danh mục chứng chuẩn âm TT AND vi khuẩn, vi TT AND vi khuẩn, vi
nấm, người
Ký hiệu Số tube Thể tích mỗi tube (µl) 1 C. albicans VK1 10 30 2 C. tropicalis VK2 10 30 3 C. krusei VK3 10 30 4 C. parapsilosis VK4 10 30 5 C. glabrata VK5 10 30 6 N. meningitidis VK6 10 30 7 H. influenzae VK7 10 30 8 S. pneumoniae VK8 10 30 9 E. coli VK9 10 30 10 S. suis VK10 10 30 11 S. aureus VK11 10 30 12 A. baumannii VK12 10 30 13 P. aeruginosa VK13 10 30
Kết quả bảng 3.8 cho thấy đã tạo ra 13 mẫu chứng chuẩn âm với tổng số 130 tube, mỗi tube chứa 30 µl ADN.
3.1.3.3. Kết quả xác định các điều kiện cho phản ứng PCR1
Kết quả tối ưu các điều kiện của phản ứng PCR1 phát hiện nấm
Thực nghiệm phản ứng PCR1 nhân gen của nấm C. neoformans theo quy trình của SH Mirhendi và cs (2001) với tổng thể tích 50 µl và số chu kỳ là 30 chu kỳ. Nhận thấy theo các nghiên cứu của các tác giả SH Mirhendi và cs (2001) sản phẩm của phản ứng PCR1 sau khi khuếch đại sẽ tiến hành phản ứng cắt bằng enzym giới hạn, do đó yêu cầu số lượng sản phẩm của phản ứng PCR phải lớn. Trong nghiên cứu của chúng tôi sau phản ứng PCR lần 1, sẽ tiến hành khuếch đại bằng phản ứng PCR lần 2, nên lượng sản phẩm ADN lần 1 không cần quá nhiều, chúng tôi thực nghiệm giảm tổng thể tích phản ứng xuống 25µl và số chu kỳ xuống 20 và 25 chu kỳ để so sánh.
Kết quả so sánh sự thay đổi này được thể hiện ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả so sánh phản ứng PCR1 với các điều kiện khác nhau
TT Thể tích và chu kỳ phản ứng Số mẫu thực nghiệm Số mẫu dương tính 1 Tổng thể tích 50 µl; 30 chu kỳ 30 30 2 Tổng thể tích 50 µl; 25 chu kỳ 30 30 3 Tổng thể tích 50 µl; 20 chu kỳ 30 30 4 Tổng thể tích 25 µl; 30 chu kỳ 30 30 5 Tổng thể tích 25 µl; 25 chu kỳ 30 30 6 Tổng thể tích 25 µl; 20 chu kỳ 30 28 7 Tổng thể tích 20 µl; 30 chu kỳ 30 29 8 Tổng thể tích 20 µl; 25 chu kỳ 30 28 9 Tổng thể tích 20 µl; 20 chu kỳ 30 26
Qua kết quả ở bảng 3.9 chúng tôi lựa chọn quy trình kỹ thuật cho phản ứng PCR1 với tổng thể tích phản ứng là 25 µl và 25 chu kỳ nhiệt.
Bảng 3.10. Kết quả chuẩn hóa từng thành phần phản ứng cho PCR1
TT Thành phần Nồng độ, hàm lượng cuối cùng
Thể tích sử dụng cho 1 phản ứng (µl) 1 Nước khử ion Vừa đủ tới 25 µl 8,5
2 Master Mix 2 X có chứa MgCl2 nồng độ 4 mM 1X 12,5 3 Mồi xi PCR1 0,02 µM 1 4 Mồi ngược PCR1 0,02 µM 1 5 ADN khn 100pg – 100ng/25µl 2 Tổng 25
Bảng 3.11. Kết quả chu trình nhiệt của phản ứng PCR1 Bước phản ứng Nhiệt độ 0C Thời gian Số chu kỳ Bước phản ứng Nhiệt độ 0C Thời gian Số chu kỳ
Tách sợi ban đầu 94 5 phút 01 Tách sợi 94 40 giây
Bám mồi 56 40 giây 25 Kéo dài mồi 72 40 giây
ổn định mồi 72 7 phút 01
Kết quả của phản ứng PCR1, theo điều kiện tại bảng 3.10 và 3.11 được thể hiện ở hình 3.9.