Tồn bộ 51 mẫu nấm dương tính tiếp tục được định danh bằng kỹ thuật PCR-RFLP theo phương pháp mô tả bởi Mirhendi và cs (2006). Kết quả cho thấy, tồn bộ 51/51 mẫu có kích thước sản phẩm PCR và cắt giới hạn phù hợp với C. neoformansnhư mô tả của Mirhendi và cs (Hình 3.2 và Hình 3.3).
Hình 3.2. Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1, ITS4 của một số mẫu nấm
C. neoformans
Trong hình, giếng số 1 là chứng âm, giếng số 5 là thang ADN chuẩn 100bp, còn lại từ giếng số 1 đến giếng số 11 lần lượt là sản phẩm PCR của các mẫu nấm có ký hiệu N57, N61, N420, N426, N427, N432, N453, N458, N471.
Hình 3.3. Kích thước các mảnh cắt giới hạn sản phẩm PCR bằng enzyme
MspI của một số mẫu nấm C. neoformans
Trong hình, giếng số 1 là đối chứng dương (nấm C. tropicalis), giếng số 8 là thang ADN chuẩn kích thước 100 bp, các từ giếng số 2 đến 7 và giếng số 9 đến 11 lần lượt là sản phẩm cắt giới hạn của các mẫu nấm có ký hiệu N57, N61, N420, N426, N427, N432, N453, N458, N471.
Kết quả giải trình tự và so sánh trình tự ngẫu nhiên 1 số mẫu cũng cho kết quả là C. neoformans. Trình tự của 06 mẫu đại diện đã được đăng ký trên ngân hàng gen ncbi.nlm.nih.gov với các mã số như trong bảng 3.2 dưới đây:
Bảng 3.2. Tỷ lệ tương đồng nucleotide của 06 mẫu trong nghiên cứu với các
trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen
Tên mẫu Mã số trên genbank
Trình tự
tham chiếu Loài nấm
Tỷ lệ tương đồng N420 MF593934.1 CP025718.1 C. neoformans 100% N426 MF593935.1 CP025718.1 C. neoformans 100% N458 MH203395.1 KM085009.1 C. neoformans 100% N460 MH203396.1 CP025718.1 C. neoformans 99,91% N461 MH203397.1 JN939455.1 C. neoformans 100% N591 MF593936.1 KM085009.1 C. neoformans 99,91%
Bảng 3.2 cho thấy, các chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam
được đăng ký trên ngân hàng gen có tỷ lệ tương đồng cao với nucleotide trình tự tham chiếu (> 99%).
Dựa trên kết quả định loại, 07 mẫu được lựa chọn để xác định các điều kiện của kỹ thuật nested-PCR phát hiện C. neoformans.
3.1.2. Kết quả thiết kế/lựa chọn mồi cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán
nhiễm nấm C. neoformans
3.1.2.1. Kết quả lựa chọn trình tự cặp mồi cho phản ứng nested PCR
Chúng tơi thống kê các bài báo trong và ngồi nước áp dụng kỹ thuật PCR để nghiên cứu định loại nấm C. neoformans từ năm 1990 đến 2014, là
thời điểm bắt đầu tiến hành nghiên cứu.
Bảng 3.3. Các phương pháp sinh học phân tử được áp dụng
để định loại nấm C. neoformans 1990 - 2014
STT Tác giả Gen đích Năm Phương pháp
1 Mitchell và cs ITS rRNA 1994 PCR
2 Rappelli và cs ITS rRNA 1998 Nested - PCR 3 Mirhend ITS + 5,6S RNA 2001 PCR-RFLP
4 Bialek và cs 18S rDNA 2002 Nested PCR + qPCR 5 Guizenluo và cs LAC1, CAP64 2002 Multiplex PCR 6 M. McClelland URA5, ADE2 2002 PCR
7 Meyer và cs URA5 2003 PCR-RFLP 8 Takahashi và cs ITS rRNA 2003 Nested PCR 9 Paschoal và cs ITS + 5,6S RNA 2004 PCR
10 Hafner và cs Microsatellitle 2005 PCR finger printing 11 Shahindokht ITS rRNA 2006 Semi nested PCR 12 Enache-A và cs CAP59 2007 AFLP
14 Leal và cs JEC21 2008 Multiplex PCR 15 Capoor và cs Microsatellitle 2008 RADP PCR 16 Vincent Veron ITS rRNA 2009 Real-time PCR 17 Saha và cs 18S rRNA 2009 PCR
18 Martins JEC21 2010 Real-time PCR 19 Qishui và cs VAD1 2012 Real-time PCR 20 Reinwald và cs 18S rRNA 2013 Nested PCR
Sau khi xem xét, so sánh đánh giá lựa chọn giữa các cặp mồi đã được các tác giả trên nghiên cứu, chúng tôi quyết định lựa chọn 02 cặp mồi cho phản ứng nested – PCR như sau:
Cặp mồi cho phản ứng PCR1 theo Mitchell TG và CS, 1994; SH Mirhendi và CS, 2001:
- ITS1 F: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’ - ITS4 R:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’
Khuếch đại đoạn gen có kích thước 555-556 bp đặc trưng cho nấmC.
neoformans
Cặp mồi cho phản ứng PCR 2 theo Guizhen Luo và CS, 2002: - CN4 F: 3’-ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T-5’
- CN5 R: 3’-GAA GGG CAT GCC TGT TTG AGA G-5’
Khuếch đại đoạn ADN có kích thước 135-136 bp nằm trong đoạn giao gen ITS1-ITS2.