tt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR
Dương tính ((+)/tổng số) Âm tính ((-)/tổng số) 1 DNT giả định nồng độ 105CFU/ ml 40/40 0/40 2 DNT giả định nồng độ 102CFU/ ml 34/40 6/40 3 NaCl 0,9% 0/20 20/20 4 DNT không nấm C. neoformans 0/20 20/20 Tổng cộng 74/120 46/120
Kết quả bảng 3.29 cho thấy pha loãng các mẫu dịch não tủy gây nhiễm nấm C. neoformans giả định ở các nồng độ khác nhau rồi chọn 40 mẫu nồng độ thấp 102CFU/ml và nồng độ cao 105CFU/ml; 20 mẫu chuẩn âm (10 chuẩn âm khơng có ADN hay chuẩn trắng NaCl 0,9% và 10 chuẩn âm có ADN – dịch não tủy khơng có C. neoformans). Thử nghiệm với bộ sinh phẩm nested- PCR #A011-02 kết cho thấy với mẫu nhiễm giả định nồng độ cao 105CFU/ml 40 mẫu dương tính chiếm 100%; với mẫu nhiễm nấm giả định nồng độ thấp 102CFU/ ml có 34/40 mẫu dương tính chiếm 85%, 6/40 mẫu âm tính chiếm 15%; 100% mẫu khơng nhiễm nấm có kết quả âm tính.
Bảng 3.30. Kết quả đánh giá của trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ 105CFU/ ml Kết quả kit Nested – PCR Mẫu chuẩn Tổng số Có C. neoformans Khơng có C. neoformans Dương tính 40 0 40 Âm tính 0 40 40 Tổng số 40 40 80 Độ nhạy Se = 100% Độ đặc hiệu Sp = 100%
Qua bảng 3.30 nhận thấy khi gây nhiễm giả định trên dịch não tủy với nồng độ cao thì độ nhạy và độ đặc hiệu vẫn đảm bảo 100%.
Bảng 3.31. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các
mẫu nhiễm giả định nồng độ 102CFU/ ml
Kết quả kit Nested – PCR Mâu chuẩn Tổng số Có C. neoformans Khơng có C. neoformans Dương tính 34 0 34 Âm tính 6 40 46 Tổng số 40 40 80 Độ nhạy Se = 85% Độ đặc hiệu Sp = 100%
Bảng 3.31 là kết quả khi gây nhiễm với nồng độ thấp102CFU/ ml xấp xỉ ngưỡng phát hiện thì độ nhạy giảm đi rõ chỉ là 85%.
Bảng 3.32. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ từ 102CFU/ ml trở lên
Kết quả kit Nested – PCR
Mẫu chuẩn Tổng số
Có C. neoformans Khơng có C. neoformans
Dương tính 74 0 74
Âm tính 6 40 46
Tổng số 80 40 120
Độ nhạy Se = 92,5% Độ đặc hiệu Sp = 100%
Với các mẫu nhiễm giả định từ ngưỡng phát hiện trở lên bộ sinh phẩm nested-PCR có độ nhạy 92.5%, độ đặc hiệu 100%. Giá trị tiên đoán dương 100%, giá trị tiên đoán âm 87% với độ tin cậy 95%.
3.2.2. Kết quả đánh giá của bộ sinh phẩm trong các mẫu dịch não tủy lâm sàng
3.2.2.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu C. neoformans phân lập ở Việt Nam
Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR trên 51 mẫu ni cấy có mật độ nấm khác nhau.
Bằng bộ sinh phẩm nested-PCR tạo ra, tiến hàng chạy lại với toàn bộ 51 mẫu ADN của 51 chủng nấm C. neoformans khác nhau phân lập ở Việt Nam, mỗi chủng chạy 2 mẫu. Kết quả cho thấy 100% sản phẩm PCR2 sau khi điện di đều xuất hiện các băng có kích thước 135 bp. Kết quả này phù hợp với nấm
Bảng 3.33. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các chủng C.neoformans
phân lập ở Việt Nam
Stt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR
Dương tính ((+)/tổng số) Âm tính ((-)/tổng số) 1 C.neoformans phân lập ở Việt Nam 102/102 0/102 5 NaCl 0,9% 0/20 20/20 6 Mẫu dịch não tủy 0/20 20/20 Tổng cộng 102/142 40/142
Hình 3.17. Kết quả khuếch đại gen đích của nấm C. neoformans
bằng kỹ thuật nested-PCR
Trong hình giếng 1: Chứng âm; giếng 2: chứng dương; Các giếng 3-10: các mẫu ADN thử nghiệm; giếng 11: thang ADN chuẩn loại 100bp.
Bảng 3.34. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các
chủng C. neoformans phân lập ở Việt Nam
Kết quả kit nested – PCR
C.neoformans phân lập ở VN Tổng số
Có C. neoformans Khơng có C. neoformans
Dương tính 102 0 102
Âm tính 0 40 40
Tổng số 102 40 142
Độ nhạy Se = 100% Độ đặc hiệu Sp = 100%
Qua kết quả ở bảng trên nhận thấy với việc đánh giá trực tiếp trên 51 mẫu nuôi cấy và 20 mẫu chuẩn âm (10 chuẩn âm khơng có ADN hay chuẩn trắng NaCl 0,9% và 10 chuẩn âm có ADN – dịch não tủy khơng có C. neoformans). Bộ sinh phẩm nested – PCR #011 – 02 có độ nhạy và độ đặc
hiệu đều đạt 100%.
3.2.2.2. Kết quả đánh giá độ tương đồng của bộ sinh phẩm trên mẫu DNT bệnh nhân viêm màng não
Kết quả xét nghiệm bằng các phương pháp khác nhau trên các mẫu dịch não tủy bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng viêm màng não được thể hiện ở bảng 3.35.
Bảng 3.35. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các mẫu DNT của bệnh
nhân có triệu chứng lâm sàng VMN
Stt Loại mẫu thực hiện Phương pháp xét nghiệm
Soi tươi nhuộm mực tàu (+/TS) Nuôi cấy (+/TS) Nested- PCR (+/TS) Kit Norgen (+/TS) 1 DNT thu thập tại BV Phạm Ngọc Thạch 5/100 6/100 5/100 5/100 2 DNT thu thập tại BV Quân Y 103 2/20 2/20 2/20 2/20 Tổng cộng 7/120 8/120 7/120 7/120 Kết quả ở bảng trên cho thấy khi xét nghiệm dịch não tủy của 120 bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng viêm màng nào thì có 8/120 mẫu dịch não tủy dương tính với C. neoformans bằng phương pháp nuôi cấy (chiếm 6,67%),
trong đó có 7 mẫu cùng dương tính với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu, bộ sinh phẩm nested –PCR #011 – 02 và bộ sinh phẩm của Norgen.
- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu với phương pháp nuôi cấy trên các mẫu
lâm sàng
Bảng 3.36. Độ nhạy, độ đặc hiệu so với phương pháp nuôi cấy
Kết quả kit nested – PCR
Phương pháp ni cấy Tổng số Dương tính Âm tính
Dương tính 7 0 7
Âm tính 1 112 113
Tổng số 8 112 120
Độ nhạy Se = 87,5% Độ đặc hiệu Sp = 100% Giá trị tiên đoán dương: 100%
So sánh kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR với phương pháp nuôi cấy độ nhạy 87,5%; độ đặc hiệu 100%. Giá trị tiên đoán dương là 100% và giá trị tiên đốn âm là 99,1%. Trong thử nghiệm có 01 mẫu dương tính với ni cấy mà âm tính với các phương pháp xét nghiệm khác. Có thể mẫu này ngoại nhiễm với C. neoformans.
- Đánh giá độ tương đồng với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu
Bảng 3.37. Độ tương đồng so với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu Kết quả kit
nested – PCR
Phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu Tổng số Dương tính Âm tính Dương tính 5 2 7 Âm tính 2 111 113 Tổng số 7 113 120 Tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 96,7%
Tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0% K = 0,697
So sánh kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu cho thấy tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 96,7%, tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0%. Hệ số tương đồng giữa 2 phương pháp xét nghiệm là 0,697 (bảng 3.37).
- Đánh giá độ tương đồng với bộ sinh phẩm của Norgen
Bảng 3.38. Độ tương đồng so với bộ sinh phẩm của Norgen Kết quả kit nested – PCR Bộ sinh phẩm Norgen Tổng số Dương tính Âm tính Dương tính 7 0 7 Âm tính 0 113 113 Tổng số 7 113 120 Tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 100%
Tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0% K = 1
So sánh kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR với bộ sinh phẩm Norgen tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 100%, tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0%. Hệ số tương đồng giữa 2 phương pháp xét nghiệm là 1 hoàn toàn tương đồng.
3.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định chất lượng bộ sinh phẩm chế tạo ra
3.2.3.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở
Dựa trên kết quả nghiên cứu về độ nhay, độ đặc hiệu, độ ổn định của phương pháp cũng như quy trình kỹ thuật nested – PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ sinh phẩm.
Bảng 3.39. Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở TT Chỉ tiêu đánh giá Tiêu chuẩn cơ sở
1 Nhận dạng Phản ứng PCR2 cho bang kích thước 135 bp đặc trưng cho nấm C.neoformans
2 Độ nhạy ≥ 95% 3 Độ đặc hiệu ≥ 99% 4 Ngưỡng phát hiện ≥ 10pg/µl
5 Thời gian phát hiện Không quá 48 giờ 6 Độ ổn định ≥ 12 tháng
3.2.3.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR tại Viện kiểm định quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế
Viện kiểm định quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế có giấy chứng nhận kết quả kiểm định số 00515/SPCD-NC kết luận bộ sinh phẩm chẩn đoán nested-PCR phát hiện nấm C. neoformans loạt số #A011-02 do Học viện quân y sản xuất có độ nhạy đạt 98,11%; độ đặc hiệu 100%; ngưỡng phát hiện 0,4pg/µl khi thực hiện trên bộ mẫu chuẩn của nhà sản xuất.
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Về kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-
PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans
4.1.1. Bàn luận về kết quả giám định loài vi nấm C. neoformans để sử
dụng cho nghiên cứu xây dựng quy trình
Nghiên cứu này đã sử dụng 01 chủng nấm chuẩn mã số ATCC® 90113 đây là chủng C. neoformans var brutii được thu thập từ mẫu dịch não tủy tại Pensivalia đã được ngân hàng chủng chuẩn vi sinh vật Hoa Kỳ phân lập, giải trình tự và miêu tả các thuộc tính một cách đầy đủ.
Bảng 3.1 cho thấy để phục vụ cho nghiên cứu trong năm 2013 chúng tôi đã tiến hành thu thập 270 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng viêm màng não từ 04 bệnh viện của Việt Nam, gồm 143 mẫu từ bệnh viện Phạm Ngọc Thạch; 04 mẫu từ Bệnh viện quân Y 103; 20 mẫu từ Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương; 99 mẫu từ Bệnh viện Chợ Rẫy. Bằng phương pháp nuôi cấy trên thạch Sabouraud đã xác định có 51 mẫu dịch não tủy nhiễm nấm C. neoformans chiếm 18,89%. Sau đó 51 chủng C. neoformans này được định loài lại bằng sinh học phân tử, kết quả cho thấy cả
51 mẫu đều cho kết quả là C. neoformans. Điều này cho thấy tỉ lệ viêm màng não do nấm C. neoformans chiếm khá cao, tương đồng với nghiên cứu tại bệnh viện Bệnh Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh từ tháng 12/2010 đến tháng 7/2011 (16,4%) (Nguyễn Như Quỳnh, (2012)). Theo Sousa và cs (2015), tỷ lệ này ở Brazil là 9,25% [56]. Theo thống kê của bệnh viện Chợ Rẫy từ năm 1999 đến 2001 tỷ lệ này thấp hơn chỉ có 5%. Số lượng mẫu thu thập trong nghiên cứu này là 167 mẫu tương đương với nghiên cứu của Nguyễn Quang Trung năm 2004, 2005 tại BV Bệnh Nhiệt Đới đã thu thập được 147 ca nhiễm
C. neoformans ở hệ thần kinh trung ương. Như vậy so với các nghiên cứu
tính với C. neoformans khác biệt. Nguyên nhân có thể do cách chọn mẫu,
trong nghiên cứu này chúng tôi thu thập dịch não tủy của tất cả các bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não ở Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ Rẫy. Nhưng ở BV Bệnh Nhiệt đới Trung ương và Bệnh viện Quân Y 103 thì lại chọn tất cả bệnh nhân viêm màng não ni cấy có nấm. Có thể do cách thu mẫu này làm cho tỉ lệ viêm màng não dương tính với C. neoformans trong nghiên cứu bước đầu của chúng tôi tỷ lệ cao hơn so với các nghiên cứu khác.
Viêm màng não do nấm là một bệnh nguy hiểm, tỷ lệ tử vong lại rất cao nên cần được chẩn đoán và điều trị càng sớm càng tốt, nhất là ở những người suy giảm miễn dịch.
Nuôi cấy được coi là phương pháp chủ yếu để chẩn đốn vi nấm nói chung trong đó có cả viêm màng não do Cryptococcus. Ni cấy cần 3 – 5 ngày để nấm phát triển và ủ lên đến 10 ngày để có được số liệu đáng tin cậy. Phương pháp ni cấy có thể phát hiện 70% các trường hợp nhiễm nấm, tuy nhiên ngưỡng phát hiện khá cao.
Các kỹ thuật miễn dịch học phát hiện kháng nguyên như ELISA, LAT... hiện nay đang được sử dụng phổ biến để phát hiện chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans tuy nhiên các phương pháp này có nhược điểm là mẫu
phải xét nghiệm ngay sau khi thu thập, quá trình bảo quản mẫu phải trong điều kiện lạnh, dễ xảy ra nhiễm chéo và dương tính giả.
Trong hai thập kỷ qua, rất nhiều kỹ thuật phân tử đã được khám phá để phát hiện nấm gây bệnh. Những kỹ thuật này, so với các kỹ thuật cổ điển, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể xác định đặc điểm sâu về cấu trúc gen của phức hệ lồi C. neoformans, thời gian chẩn đốn nhanh. Các kỹ thuật này có
tính đặc hiệu cao do việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho từng đối tượng nghiên cứu và có độ nhạy cao vì chỉ cần một lượng rất nhỏ (vài picrogam) ADN cũng có thể cho kết quả chẩn đốn.
Ngồi ra các kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên kỹ thuật PCR là các kỹ thuật có thể tiến hành nhanh, dễ dàng, tốn ít thời gian hơn so với các kỹ thuật lai protein. Đồng thời kỹ thuật PCR cũng có thể kết hợp với các kỹ thuật khác như xác định dấu ấn phân tử, tạo ra các công cụ hữu hiệu cho việc nghiên cứu dịch tễ học phân tử [48].
Có rất nhiều các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để chẩn đoán nấm C. neoformans trong đó các kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất là kỹ thuật PCR, nested – PCR; PCR đa mồi, real-time PCR…[56], [60],[62],[48]. Mỗi một kỹ thuật trên có các ưu nhược điểm khác nhau như: Kỹ thuật PCR thông thường dễ thực hiện, nhanh nhưng cũng có những nhược điểm nhất định như chỉ phát hiện được một nầm bệnh cùng lúc, nồng độ giới hạn phát hiện cao hơn so với các kỹ thuật PCR lồng (nested PCR)…
Kỹ thuật PCR đa mồi có ưu điểm chẩn đốn nhanh, cùng lúc xác định được sự có mặt của một hoặc nhiều mầm bệnh, tuy nhiên độ đặc hiệu có thể thấp hơn kỹ thuật PCR đơn hay nested-PCR. Q trình chuẩn hóa kỹ thuật cũng phức tạp hơn nhiều để có thể đảm bảo được tính đặc hiệu của kỹ thuật khi chẩn đoán cùng một lúc nhiều mầm bệnh khác nhau cũng như trong trường hợp các mầm bệnh có mật độ khác nhau [60], [91].
Kỹ thuật real-time PCR là một trong những kỹ thuật hiện đại nhất trong các phương pháp áp dụng cho nghiên cứu, chẩn đoán bệnh Cryptococcosis và các tác nhân gây bệnh khác hiện nay. Kỹ thuật này có thời gian thực hiện ngắn, nên có thể phát hiện bệnh nhanh. Đồng thời độ chính xác trong chẩn đoán C. neoformans cao. Tuy nhiên kỹ thuật này đòi hỏi trang thiết bị chuyên dụng và đắt tiền hơn so với các kỹ thuật PCR khác [62],[66].
Kỹ thuật nested PCR là kỹ thuật có 2 lần phản ứng với 2 cặp mồi khác nhau, cặp mồi thứ nhất được sử dụng để khuếch đại một đoạn ADN chứa đoạn ADN của l phản ứng PCR lần hai nên độ đặc hiệu rất cao. Trong số các
kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR thì PCR lồng được sử dụng nhiều nhất, kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, ngưỡng phát hiện thấp, tỷ lệ phát hiện nấm có thể tới hơn 90% [47], [48].
Trong điều kiện thực tế Việt Nam, chúng tôi lựa chọn phát triển kỹ thuật nested-PCR để phát triển bộ sinh phẩm với hy vọng có thể áp dụng được ở tất cả những cơ sở y tế có máy PCR để có thể chẩn đốn sớm, chẩn đốn chính xác nhiễm nấm C. neoformans - một trong những tác nhân nguy hiểm
gây bệnh viêm màng não.
Để phát triển kỹ thuật nested-PCR xác định nhiễm nấm trong dịch não tủy chúng tôi đã tiến hành thu thập từ 2 ml đến 6 ml dịch não tủy. Mỗi lần tách chiết cần 500µl dịch não tủy, đủ cho tiến hành lặp lại thí nghiệm nhiều lần. Do đó lượng mẫu này hoàn toàn đủ cho việc thử nghiệm xây dựng kỹ thuật nested –PCR.