Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Sinh tổng hợp vanillin từ axit fefulic sử dụng E.coli tái tổ hợp làm tế bào
3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic đến sinh trưởng của E. coli
Nồng độ axit ferulic cao gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của E. coli [43] [84]. Để tối ưu hóa năng suất sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic trước hết phải xác định được nồng độ axit ferulic tối đa bổ sung vào môi trường nuôi cấy mà không ảnh hưởng đến sinh trưởng tế bào. Dải nồng độ axit ferulic ban đầu được lựa chọn thử nghiệm nằm trong khoảng 1 g/L đến 5 g/L căn cứ theo một số nghiên cứu trước [43]. Axit ferulic được bổ sung vào dịch nuôi cấy khi OD260nm đạt 0.6 và nuôi tiếp 36 tiếng, là khoảng thời gian nuôi cấy có thể sinh tổng hợp vanillin tối đa.
Hình 3.22: Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic ban đầu với sinh trưởng của E. coli tái tổ hợp mang vector pET22-GEF
Kết quả trên hình 3.22 cho thấy nồng độ axit ferulic 3 g/L là nồng độ cao nhất có thể sử dụng mà ít gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của tế bào E. coli. Kết quả này phù hợp với công bố trước [43]. Nồng độ 3 g/L axit ferulic được lựa chọn cho các bước tối ưu hóa tiếp theo.
3.4.2. Xác định axit ferulic tồn dư và vanillin được tổng hợp bởi hệ thống pET22
Dòng E. coli tái tổ hợp chủng BL21(DE3) mang vector pET22-GEF được sử dụng để sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic.
Hình 3.23: Phân tích HPLC động học sự chuyển hóa axit ferulic thành vanillin ở chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang vector pET22-GEF.
(I) cơ chất ferulic axit và vanillin chuẩn; (II) sự chuyển hóa axit ferulic (FA) thành vanillin (VA) sau 12 giờ nuôi cấy; (III) sự chuyển hóa FA thành VA sau 36 giờ nuôi cấy. Axit ferulic (3 g/L) và IPTG (1 mM) được bổ sung vào dịch nuôi cấy tại thời điểm 4h khi OD600nm đạt 0.4
Kết quả ở hình 3.23.I cho thấy các đỉnh tương ứng với hai chất chuẩn axit ferulic và vanillin thể hiện rõ ràng. Hình 3.23.II và III cho thấy lượng axit ferulic bổ sung vào dịch nuôi cấy bị giảm đi theo thời gian do được sử dụng làm cơ chất để chuyển hóa thành vanillin. Lượng vanillin sản phẩm được tạo thành tăng tương ứng theo thời gian. Kết quả này cho thấy hệ thống sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit ferulic sử dụng tế bào E. coli tái tổ hợp do chúng tôi thiết kế đã hoạt động thành công.
Tiếp theo, nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá một số điều kiện của hệ