4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.6. So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin giữa hai hệ vector
pRSET
Dựa trên sự phân tắch chuyển hóa ở chủng E. coli BL21(DE3)/pET-GEF, chúng tôi đã tiến hành phân tắch tương tự với chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang vector pRSET-GEF. Hiệu quả chuyển hóa axit ferulic thành vanillin giữa hai hệ thống vector được so sánh trên hình 3.27.
Hình 3.27: So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit ferulic sử dụng các chủng E. coli tái tổ hợp mang vector pET22-GEF và
Hình 3.27 cho thấy hệ thống biểu hiện trên nền tảng vector pET22b(+) có hiệu suất sinh tổng hợp vanillin đạt 1.44 g/L cao hơn so với mức 1.17 g/L của vector pRSET-A. Một trong những cơ sở có thể lý giải hiện tượng này là do ở hệ thống pET22b(+) protein tái tổ hợp được dung hợp với trình tự tắn hiệu pelB và do đó được định vị ra ngoài khoang chu chất, nhờ đó giảm được tác dụng phân hủy của các protease nội bào và tăng khả năng tiết ra môi trường.
Mặt khác, vector pRSET-A với điểm khởi đầu sao chép pUC được xếp vào nhóm vector có số lượng bản sao lớn (khoảng 500 bản sao/tế bào) trong khi pET22b(+) với điểm khởi đầu sao chép pBR322 thuộc nhóm số lượng bản sao thấp (khoảng 15 đến 20 bản sao/tế bào). Kết quả so sánh 2 hệ vector cho thấy số lượng bản sao của vector có ảnh hưởng đến mức độ sinh tổng hợp vanillin. Công bố trước đây của Jones và cộng sự [34] kết luận số lượng bản sao của plasmid không ảnh hưởng tới sinh tổng hợp của chất đắch. Tuy nhiên, dữ liệu của chúng tôi đồng thuận hơn với công bố của Barghini và cộng sự [12] khi vanillin được tổng hợp mạnh hơn khi sử dụng plasmid số lượng bản sao thấp và promoter hiệu suất thấp.
Hiệu suất sinh tổng hợp vanillin trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn mức 580 mg/L theo Yoon và cộng sự (2005) [84] khi gene gltA chưa được sử dụng. Dữ liệu này góp phần khẳng định vai trò của gene gltA trong sinh tổng hợp vanillin bằng E. coli tái tổ hợp vì gene này giúp tái sử dụng acetyl-CoA theo chu trình [43].
Chương 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
1. Tách dòng thành công 3 gene mã hóa con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic, bao gồm: gltA, ech và fcs.
2. Thiết kế thành công 2 vector biểu hiện mang các gene gltA, ech và fcs là: pRSET-GEF và pET22-GEF.
3. Đã cảm ứng biểu hiện các gen đắch để sản xuất vanillin từ axit ferulic sử dụng vật chủ E. coli BL21(DE3).
4. Phân tắch lđược hiệu suất sinh tổng hợp vanillin tạo thành của E. coli tái tổ hợp bằng phương pháp HPLC. Hệ thống pET22-GEF và pRSET-GEF đạt hiệu suất lần lượt là 1.44 g/L và 1.17 g/L.
4.2. Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu quy trình lên men E.coli sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic để thu hồi vanillin thành phẩm.
Tiếp tục nghiên cứu tăng cường năng suất sinh tổng hợp vanillin theo các hướng sau:
-Bất hoạt con đường trao đổi chất cạnh tranh để dồn nguồn năng lượng và vật chất cho con đường sinh tổng hợp vanillin
-Giảm độc cho tế bào vật chủ bằng cách (1) sử dụng các chất hấp phụ; (2) chọn lọc các chủng đột biến kháng vanillin/axit ferulic
-Thiết lập các quy trình lên men hiệu quả hơn như lên men đáp ứng bề mặt hoặc lên men liên tục.
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tiếng Việt
1. Đinh Thị Ngọ, Nguyễn Bắch Thuỷ, Đào Văn Tường (1991) Tổng hợp vanillin từ eugeneol. Tạp chắ Hóa học 29 (4): 21-27.
2. Đinh Thị Ngọ, Nguyễn Thị Bắch Thuỷ, Đào Văn Tường (1992) Nghiên cứu oxy hóa lignin thành vanillin, Tạp chắ Hóa học
3. Đinh Thị Ngọ (1996) Tổng hợp vanillin từ tinh dầu lá quế. Tạp chắ Khoa học & công nghệ
4. Phùng Thu Nguyệt, Nguyễn Hồng Thanh, Jan-Christer Janson, Trương Nam Hải (2009) Nghiên cứu lên men lượng lớn chủng Escherichia coli BL21 tái tổ hợp mang gene mã hóa lipase của Bacillus subtilis FS2. Tạp chắ Khoa học và Công nghệ, Tập 47, số 2, Tr109-116
II. Tiếng Anh
5. Abraham, D. J., Mehanna, A. S., Wireko, F. C., Whitney, J., Thomas, R. P., & Orringer, E. P. (1991). Vanillin, a potential agenet for the treatment of sickle cell anemia. Blood, 77(6), 1334-1341.
6. Achterholt, S., Priefert, H., & Steinbuchel, A. (2000). Identification of amycolatopsis sp. Strain hr167 genes, involved in the bioconversion of axit ferulic to vanillin. Appl Microbiol Biotechnol, 54(6), 799-807.
7. Akagi, K., Hirose, M., Hoshiya, T., Mizoguchi, Y., Ito, N., & Shirai, T. (1995). Modulating effects of ellagic acid, vanillin and quercetin in a rat medium term multi-organ carcinogenesis model. Cancer Lett, 94(1), 113-121.
8. Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F. (2011a). Candida galli strain pgo6: A novel isolated yeast strain capable of transformation of isoeugeneol into vanillin and vanillic acid. Curr Microbiol, 62(3), 990-998. doi:10.1007/s00284-010-9815-y
9. Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F. (2011b). Pseudomonas resinovorans spr1, a newly isolated strain with potential of transforming eugeneol to vanillin and vanillic acid. N Biotechnol, 28(6), 656- 664. doi:10.1016/j.nbt.2011.06.009
10.Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F. (2011c). Use of growing cells of pseudomonas aeruginosa for synthesis of the natural vanillin via conversion of isoeugeneol. Iran J Pharm Res, 10(4), 749-757. 11.Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F. (2012).
Conversion of isoeugeneol to vanillin by psychrobacter sp. Strain csw4.
Applied Biochemistry and Biotechnology, 166(1), 1-12. doi:10.1007/s12010- 011-9397-6
12.Barghini, P., Di Gioia, D., Fava, F., & Ruzzi, M. (2007). Vanillin production using metabolically engineered escherichia coli under non-growing conditions. Microb Cell Fact, 6, 13. doi:10.1186/1475-2859-6-13
13.Barthelmebs, L., Divies, C., & Cavin, J.-F. (2000). Knockout of the p-coumarate decarboxylase gene from lactobacillus plantarum reveals the existence of two other inducible enzymatic activities involved in phenolic acid metabolism.
Applied and Environmental Microbiology, 66(8), 3368-3375. doi:10.1128/aem.66.8.3368-3375.2000
14.Berza, I., Dishlers, A., Petrovskis, I., Tars, K., & Kazaks, A. (2013). Plasmid dimerization increases the production of hepatitis b core particles in e. Coli.
Biotechnology and Bioprocess Engineering, 18(5), 850-857. doi:10.1007/s12257-013-0188-5
15.Bjụrsvik, H.-R., & Liguori, L. (2002). Organic processes to pharmaceutical chemicals based on fine chemicals from lignosulfonates. Organic Process Research & Development, 6(3), 279-290. doi:10.1021/op010087o
16.Boonchird, C., & Flegel, T. W. (1982). In vitro antifungal activity of eugeneol and vanillin against candida albicans and cryptococcus neoformans. Can J Microbiol, 28(11), 1235-1241.
17.Calisti, C., Ficca, A. G., Barghini, P., & Ruzzi, M. (2008). Regulation of ferulic catabolic genes in pseudomonas fluorescens bf13: Involvement of a marr family regulator. Applied Microbiology and Biotechnology, 80(3), 475-483. doi:10.1007/s00253-008-1557-4
18.Converti, A., Aliakbarian, B., Dominguez, J. M., Bustos Vazquez, G., & Perego, P. (2010). Microbial production of biovanillin. Braz J Microbiol, 41(3), 519- 530. doi:10.1590/s1517-83822010000300001
19.Di Gioia, D., Luziatelli, F., Negroni, A., Ficca, A. G., Fava, F., & Ruzzi, M. (2010). Metabolic engineering of pseudomonas fluorescens for the production of vanillin from axit ferulic. J Biotechnol, 156(4), 309-316. doi:10.1016/j.jbiotec.2011.08.014
20.Dignum, M. J. W., Kerler, J., & Verpoorte, R. (2001). Vanilla production: Technological, chemical, and biosynthetic aspects. Food Reviews International, 17(2), 119-120. doi:10.1081/FRI-100000269
21.Durant, S., & Karran, P. (2003). Vanillins--a novel family of ADN-pk inhibitors.
Nucleic Acids Res, 31(19), 5501-5512.
22.Edlin, D. A. N., Narbad, A., Gasson, M. J., Dickinson, J. R., & Lloyd, D. (1998). Purification and characterization of hydroxycinnamate decarboxylase from brettanomyces anomalus. Enzyme and Microbial Technology, 22(4), 232-239. doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0141-0229(97)00169-5
23.Fitzgerald, D. J., Stratford, M., Gasson, M. J., & Narbad, A. (2005). Structure- function analysis of the vanillin molecule and its antifungal properties. J Agric Food Chem, 53(5), 1769-1775. doi:10.1021/jf048575t
24.Furia, T. E., & Bellanca, N. (1975). Fenaroli's handbook of flavor ingredients: C R C Press LLC.
25.Gasson, M. J., Kitamura, Y., McLauchlan, W. R., Narbad, A., Parr, A. J., Parsons, E. L., . . . Walton, N. J. (1998). Metabolism of axit ferulic to vanillin. A bacterial gene of the enoyl-scoa hydratase/isomerase superfamily encodes an enzyme for the hydration and cleavage of a hydroxycinnamic acid scoa thioester. J Biol Chem, 273(7), 4163-4170.
26.Gupta, J., Hamp, S., Buswell, J., & Eriksson, K.-E. (1981). Metabolism of trans- axit ferulic by the white-rot fungus sporotrichum pulverulentum. Archives of Microbiology, 128(4), 349-354. doi:10.1007/BF00405911
27.Gustafson, D. L., Franz, H. R., Ueno, A. M., Smith, C. J., Doolittle, D. J., & Waldren, C. A. (2000). Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) inhibits mutation induced by hydrogene peroxide, n-methyl-n-nitrosoguanidine and mitomycin c but not 137cs γ-radiation at the cd59 locus in humanỜhamster hybrid al cells. Mutagenesis, 15(3), 207-213. doi:10.1093/mutage/15.3.207 28.Havkin-Frenkel, D., & Belanger, F. (2007). Application of metabolic engineering
Alfermann, & T. S. Johnson (Eds.), Applications of plant metabolic engineering (pp. 175-196): Springer Netherlands.
29.Havkin-Frenkel, D., & Belanger, F. (2010). Handbook of vanilla science and technology: Wiley.
30.Havkin-Frenkel, D., Podstolski, A., & Knorr, D. (1996). Effect of light on vanillin precursors formation by in vitro cultures of vanilla planifolia. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 45(2), 133-136. doi:10.1007/BF00048756
31.Hopp, R., & Rabenhorst, J. (2000). Process for the preparation of vanillin and microorganisms suitable therefor: Google Patents.
32.Huang, Z., Dostal, L., & Rosazza, J. P. (1993a). Mechanisms of axit ferulic conversions to vanillic acid and guaiacol by rhodotorula rubra. J Biol Chem, 268(32), 23954-23958.
33.Huang, Z., Dostal, L., & Rosazza, J. P. (1993b). Microbial transformations of axit ferulic by saccharomyces cerevisiae and pseudomonas fluorescens. Appl Environ Microbiol, 59(7), 2244-2250.
34.Jones, K. L., Kim, S. W., & Keasling, J. D. (2000). Low-copy plasmids can perform as well as or better than high-copy plasmids for metabolic engineering of bacteria. Metab Eng, 2(4), 328-338. doi:10.1006/mben.2000.0161
35.Kamat, J., Ghosh, A., & Devasagayam, T. A. (2000). Vanillin as an antioxidant in rat liver mitochondria: Inhibition of protein oxidation and lipid peroxidation induced by photosensitization. Molecular and Cellular Biochemistry, 209(1- 2), 47-53. doi:10.1023/A:1007048313556
36.Kamoda, S., Habu, N., Samejima, M., & Yoshimoto, T. (1989). Purification and some properties of lignostilbene-?,?-dioxygenease responsible for the c?-c? Cleavage of a diarylpropane type lignin model compound from pseudomonas sp. Tmy1009. Agricultural and biological chemistry, 53(10), 2757-2761. 37.Kanski, J., Aksenova, M., Stoyanova, A., & Butterfield, D. A. (2002). Axit ferulic
antioxidant protection against hydroxyl and peroxyl radical oxidation in synaptosomal and neuronal cell culture systems in vitro: Structure-activity studies. The Journal of nutritional biochemistry, 13(5), 273-281.
38.Keen, H., Glynne, A., Pickup, J. C., Viberti, G. C., Bilous, R. W., Jarrett, R. J., & Marsden, R. (1980). Human insulin produced by recombinant ADN
technology: Safety and hypoglycaemic potency in healthy men. Lancet, 2(8191), 398-401.
39.Kirk, R. E., & Othmer, D. F. (1983). Kirk-othmer encyclopedia of chemical technology: Sulfonation and sulfation to thorium and thorium compounds: Wiley. 40.Knuth, M. E., & Sahai, O. P. (1991). Flavor composition and method: Google Patents. 41.Krueger DA, K. H. (1985). Detection of fraudulent vanillin labeled with 13c in
the carbonyl carbon. J. Agric Food Chem, 33, 323-325.
42.Kumar, R., Sharma, P. K., & Mishra, P. S. (2012). Cheminform abstract: Vanillin derivatives showing various biological activities. ChemInform, 43(28), no-no. doi:10.1002/chin.201228263
43.Lee, E. G., Yoon, S. H., Das, A., Lee, S. H., Li, C., Kim, J. Y., . . . Kim, S. W. (2009). Directing vanillin production from axit ferulic by increased acetyl-coa consumption in recombinant escherichia coli. Biotechnol Bioeng, 102(1), 200- 208. doi:10.1002/bit.22040
44.Lomascolo, A., Stentelaire, C., Asther, M., & Lesage-Meessen, L. (1999). Basidiomycetes as new biotechnological tools to generate natural aromatic flavours for the food industry. Trends in biotechnology, 17(7), 282-289.
45.López-Malo, A., Alzamora, S. M., & Argaiz, A. (1995). Effect of natural vanillin on germination time and radial growth of moulds in fruit-based agar systems.
Food Microbiology, 12(0), 213-219. doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0740- 0020(95)80100-6
46.Luziatelli, F., & Ruzzi, M. Genetic engineering of escherichia coli to enhance biological production of vanillin from axit ferulic.
47.Makni, M., Chtourou, Y., Barkallah, M., & Fetoui, H. (2012). Protective effect of vanillin against carbon tetrachloride (ccl4)-induced oxidative brain injury in rats. Toxicology and Industrial Health, 28(7), 655-662. doi:10.1177/0748233711420472
48.Markus, P. H., Peters, A. L., & Roos, R. (1994). Process for the preparation of phenylaldehydes: Google Patents.
49.Martắnez-Cuesta, M. d. C., Payne, J., Hanniffy, S. B., Gasson, M. J., & Narbad, A. (2005). Functional analysis of the vanillin pathway in a vdh-negative mutant strain of pseudomonas fluorescens an103. Enzyme and Microbial Technology, 37(1), 131-138. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.enzmictec.2005.02.004
50.Mathew, S., & Abraham, T. E. (2006). Bioconversions of axit ferulic, an hydroxycinnamic acid. Crit Rev Microbiol, 32(3), 115-125. doi:10.1080/10408410600709628
51.Muheim, A., & Lerch, K. (1999). Towards a high-yield bioconversion of axit ferulic to vanillin. Applied Microbiology and Biotechnology, 51(4), 456-461. doi:10.1007/s002530051416
52.Muheim, A., MỵLLER, B., Mủnch, T., & Wetli, M. (2012). Process for the production of vanillin: Google Patents.
53.Narbad, A., & Gasson, M. J. (1998). Metabolism of axit ferulic via vanillin using a novel coa-dependent pathway in a newly-isolated strain of pseudomonas fluorescens. Microbiology, 144 ( Pt 5), 1397-1405.
54.Nausch, H., Huckauf, J., Koslowski, R., Meyer, U., Broer, I., & Mikschofsky, H. (2013). Recombinant production of human interleukin 6 in escherichia coli.
PLoS One, 8(1), e54933. doi:10.1371/journal.pone.0054933
55.Ner, S. S., Bhayana, V., Bell, A. W., Giles, I. G., Duckworth, H. W., & Bloxham, D. P. (1983). Complete sequence of the glta gene encoding citrate synthase in escherichia coli. Biochemistry, 22(23), 5243-5249. doi:10.1021/bi00292a001 56.Ngarmsak, M., Delaquis, P., Toivonen, P., Ngarmsak, T., Ooraikul, B., & Mazza,
G. (2006). Antimicrobial activity of vanillin against spoilage microorganisms in stored fresh-cut mangoes. J Food Prot, 69(7), 1724-1727.
57.Odoux, E., Escoute, J., Verdeil, J. L., & Brillouet, J. M. (2003). Localization of beta-d-glucosidase activity and glucovanillin in vanilla bean (vanilla planifolia andrews). Ann Bot, 92(3), 437-444. doi:10.1093/aob/mcg150
58.Ou, S., & Kwok, K.-C. (2004). Axit ferulic: Pharmaceutical functions, preparation and applications in foods. Journal of the science of food and agriculture, 84(11), 1261-1269. doi:10.1002/jsfa.1873
59.Overhage, J., Priefert, H., & Steinbuchel, A. (1999). Biochemical and genetic analyses of axit ferulic catabolism in pseudomonas sp. Strain hr199. Appl Environ Microbiol, 65(11), 4837-4847.
60.Overhage, J., Steinbuchel, A., & Priefert, H. (2003). Highly efficient biotransformation of eugeneol to axit ferulic and further conversion to vanillin in recombinant strains of escherichia coli. Appl Environ Microbiol, 69(11), 6569-6576.
61.Plaggeneborg, R., Overhage, J., Loos, A., Archer, J. C., Lessard, P., Sinskey, A., . . . Priefert, H. (2006). Potential of rhodococcus strains for biotechnological vanillin production from axit ferulic and eugeneol. Applied Microbiology and Biotechnology, 72(4), 745-755. doi:10.1007/s00253-005-0302-5
62.Plaggeneborg, R., Overhage, J., Steinbủchel, A., & Priefert, H. (2003). Functional analyses of genes involved in the metabolism of axit ferulic in pseudomonas putida kt2440. Applied Microbiology and Biotechnology, 61(5-6), 528-535. doi:10.1007/s00253-003-1260-4
63.Plaggeneborg, R., Steinbuchel, A., & Priefert, H. (2001). The coenzyme a- dependent, non-beta-oxidation pathway and not direct deacetylation is the major route for axit ferulic degradation in delftia acidovorans. FEMS Microbiol Lett, 205(1), 9-16.
64.Rabenhorst, J. D., & Hopp, R. D. (1997). Verfahren zur herstellung von vanillin und dafủr geeignete mikroorganismen: Google Patents.
65.Ramachandra Rao, S., & Ravishankar, G. A. (2000). Vanilla flavour: Production by conventional and biotechnological routes. Journal of the science of food and agriculture, 80(3), 289-304.
66.Ranadive, A. S. (1994). Vanilla--cultivation, curing, chemistry, technology and commercial products. Developments in food science., 34, 517-577.
67.Ravendra, K., Sharma, P. K., & Prem Shanker, M. (2012). Cheminform abstract: Vanillin derivatives showing various biological activities. ChemInform, 43(28). doi:10.1002/chin.201228263
68.Rezaei, M., & Zarkesh-Esfahani, S. H. (2012). Optimization of production of recombinant human growth hormone in escherichia coli.
69.Rosazza, J. P. N., Huang, Z., Dostal, L., Volm, T., & Rousseau, B. (1995). Review: Biocatalytic transformations of axit ferulic: An abundant aromatic natural product. Journal of Industrial Microbiology, 15(6), 457-471. doi:10.1007/BF01570016
70.Shimoni, E., Ravid, U., & Shoham, Y. (2000). Isolation of a bacillus sp. Capable of transforming isoeugeneol to vanillin. J Biotechnol, 78(1), 1-9.
71.Sinha, A. K., Sharma, U. K., & Sharma, N. (2008). A comprehensive review on vanilla flavor: Extraction, isolation and quantification of vanillin and others
constituents. Int J Food Sci Nutr, 59(4), 299-326. doi:10.1080/09687630701539350
72.Srinivasan, M. R., & Chandrasekhara, N. (1992). Comparative influence of vanillin & capsaicin on liver & blood lipids in the rat. Indian J Med Res, 96, 133-135.
73.Sutherland, J. B., Crawford, D. L., & Pometto, A. L., 3rd. (1983). Metabolism of cinnamic, p-coumaric, and axit ferulics by streptomyces setonii. Can J Microbiol, 29(10), 1253-1257.
74.Tawatsin, A., Wratten, S. D., Scott, R. R., Thavara, U., & Techadamrongsin, Y.