4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.1.2. Các vector tách dòng và biểu hiện nền tảng
Vector tách dòng pTZ57R/T
Đây là một vector tách dòng dùng cho mục đắch tạo dòng các gene gltA, ech, fcs
Vector pTZ57R/T là vector tách dòng TA, có kắch thước 2886 bp, được thiết kế dựa vào hoạt tắnh terminal transferase của enzyme Taq-ADN polymerase trong phản ứng PCR. Vector pTZ57R/T có đầu dắnh là một nucleotide T (thymine), cho phép tách dòng tất cả các trình tự khuếch đại của phản ứng PCR do enzyme Taq-ADN polymerase tổng hợp.
Trong cấu trúc của vector pTZ57R/T bao gồm hai hệ thống chọn lọc, cho phép chọn lọc các dòng tế bào mang plasmid đã gắn xen trình tự đắch thành công.
- Hệ thống chọn lọc thứ nhất là gene kháng kháng sinh ampicilin mã hóa cho enzyme phân giải kháng sinh ampicilin, điều này đồng nghĩa với việc các tế bào mang vector pTZ57R/T có thể sống sót và phát triển trên môi trường có chứa kháng sinh ampicilin.
- Hệ thống chọn lọc thứ hai là hệ thống chỉ thị màu Lac-operon, hệ thống này bao gồm gene LacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase và Lac-promoter cảm ứng bởi IPTG. Với các tế bào chủ mang vector pTZ57R/T tự đóng vòng hay không có sự gắn xen xảy ra, Lac-operon hoạt động bình thường.
Trong môi trường có IPTG, enzyme β-galactosidase được tổng hợp. Enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa cơ chất X-gal thành chất có màu xanh, làm cho khuẩn lạc bao gồm các tế bào này có màu xanh. Trường hợp thứ hai là khi cấu trúc của Lac- operon bị phá vỡ do gắn xen thành công, dẫn đến enzyme β-galactosidase không được tổng hợp, không có sự phân giải cơ chất X-gal nên các khuẩn lạc này sẽ có màu trắng.
Bảng 2.1: Các thành phần của vector pTZ57R/T
Thành phần Vai trò Vị trắ
Vị trắ đa tách dòng (Multiple cloning site)
Cắt kiểm tra đoạn xen được nhân dòng, phục vụ cho công việc lập thư viện ADN
615-695
LacZα
Chọn lọc, giúp phân biệt các dòng tế bào mang vector có và không có đoạn xen
449-739 Gene kháng kháng sinh
ampicilin (Amp resistant gene)
Chọn lọc, nhằm duy trì các dòng tế bào
mang vector pTZ57R/T 1896-2756 Điểm khởi đầu sao chép
rep (pMB1)
Chịu trách nhiệm cho sự tái bản của
vector pTZ57R/T trong E. coli 1122-1736 T7 promoter Phiên mã in vitro đoạn chèn AND với T7
RNA polymerase 697-716
Phage f1 origin Tổng hợp 1 chuỗi AND đơn 2-457
Vector biểu hiện pRSET-A
Đây là vector biểu hiện sử dụng promoter T7 là promoter biểu hiện mạnh. Sơ đồ vector được thể hiện trên hình 3.2. Các thành phần và vai trò của chúng trong vector được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 2.2: Các thành phần của vector pRSET Ờ A
Thành phần Vai trò Vị trắ
Vùng khởi đầu sao chép pUC ori
Cho phép tạo ra số lượng bản sao plasmid lớn trong E
.coli
Base 2047 Ờ 2720
Gene kháng Ampicilin Chọn lọc các dòng mang vector tái tổ hợp
Base 1042 Ờ 1902 T7 promoter Kiểm soát chặt chẽ sự biểu
hiện của gene
Base 20 Ờ 39 Vị trắ đa tách dòng (MCS) Cho phép gắn gene quan tâm Base 202 Ờ 248
XpressTM Epitope Base 169 Ờ 192
Tắn hiệu kết thúc của T7 Cho phép kết thúc quá trình phiên mã
Base 256 Ờ 385
Vị trắ của mồi ngược cho T7 promoter
Đảm bảo trật tự các đoạn chèn
Base 295 Ờ 314
F1 ori Cho phép tổng hợp sợi ADN Base 456 Ờ 911
Vector biểu hiện pET22b(+)
Đây là một vector biểu hiện có các yếu tố cần thiết cho sự biểu hiện các gene gltA, ech, fcs.
Các thành phần cấu tạo trong vector pRT22b(+) được thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 2.3: Các thành phần của vector pET22b (+)
Thành phần Vị trắ
T7 promoter 361-377
T7 transcription start 360
pelB coding sequence 224-289
Multiple cloning sites (NcoI Ờ XhoI) 158-225
HisỚTag coding sequence 140-157
T7 terminator 26-72
lacI coding sequence 764-1843
pBR322 origin 3277
bla coding sequence 4038-4895
f1 origin 5027-5482
Vector pET22b(+) được thiết kế có vùng đa tách dòng (hình 3.3) với 15 vị trắ cắt cho các enzyme giới hạn: AvaI, XhoI, NotI, EagI, HindIII, SacI, EcoRI, BamHI, NcoI, MscI, BseRI, BspMI, NdeI, XbaI, cho phép gắn các gene quan tâm vào vector và biểu hiện ra sản phẩm mong muốn. Tất cả đều cho một vị trắ cắt duy nhất trên vector, đảm bảo việc gắn gene một các đặc hiệu và gene được gắn không bị mất đi ở những bước cắt, gắn nối tiếp theo. Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, tôi quy định chiều từ BamHI đến HindIII là chiều 5Ỗ→3Ỗ.
Vector pET22b(+) mang trình tự C-terminal His*tag, thuận lợi cho việc tinh sạch protein, vị trắ khởi đầu sao chép tạo ra số bản sao thấp (low copy) trong tế bào E. coli.
Promoter T7 cho phép tế bào kiểm soát chặc chẽ sự biểu hiện của gene thông qua hệ thống gene điều hòa, có khả năng biểu hiện cao khi cảm ứng IPTG.
Gene kháng ampicillin giúp cho vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa kháng sinh, giúp chọn lọc những dòng có mang plasmid mong muốn.
Lý do tôi sử dụng vector pET22b(+) là do pET22b(+) có chứa thêm một trình tự chuỗi tắn hiệu N-terminal pelB quy định tiết protein vào khoang chu chất (hay gian bào), điều này có nhiều ưu điểm đó là giảm sự phân cắt protein đắch, protein không gây độc cho tế bào, hầu hết protein khi được tiết ra khoang chu chất đều là protein tan, có chức năng sinh học. Khoang chu chất của tế bào E. coli chứa các enzyme xúc tác việc tạo thành hoặc tái sắp xếp cầu disulfide, vì vậy các protein tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli thường được định hướng vận chuyển đến đây.