4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1.2. Tách dòng và giải trình tự gene ech từ Pseudomonas fluorescens
VTCC-B-668
Kết quả khuếch đại gene ech từ cặn tế bào Pseudomonas fluorescens
bằng phương pháp PCR
Hình 3.4: Kết quả PCR khuếch đại gene ech
Đường chạy 1: Sản phẩm PCR; Đường chạy M: Thang ADN chuẩn 1 kb
Sản phẩm PCR gene ech có kắch thước dự kiến là 860 bp. Sản phẩm PCR thu được 1 băng sáng rõ duy nhất nằm trong khoảng kắch thước, đây có thể là gene ech theo lý thuyết.
Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech bằng điện di so sánh kắch thước
1 kb 750 bp ≈860 bp
Sau khi gắn gene ech vào vector pTZ57R/T và biến nạp sản phẩm gắn nối vào E. coli DH5α, kết quả thu được 15 dòng khuẩn lạc trắng và 6 khuẩn lạc xanh. Chọn ngẫu nhiên 9 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh nuôi trong môi trường LB lỏng thu sinh khối, tách chiết plasmid và kết quả điện di như sau:
Hình 3.5: Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech
Đường chạy 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Plasmid các dòng khuẩn lạc trắng Đường chạy 10: Plasmid dòng khuẩn lạc xanh
Plasmid các dòng sau khi điện di đều cho 2 băng tương ứng với hai cấu hình dạng siêu xoắn ở dýới và dạng vòng ở trên. Plasmid các dòng 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 cho vị trắ băng cao hơn so với dòng khuẩn lạc xanh, đây có thể là những dòng mang pTZ-ech.
Dòng 3, 5 có vị trắ băng plasmid tương đương với dòng khuẩn lạc xanh, đây có thể cũng là vector tự đóng vòng, nhưng lại cho khuẩn lạc màu trắng, điều này có thể là do trải Xgal không đều trên đĩa thạch nên ở vị trắ đó không có cơ chất để vector tự đóng vòng biểu hiện enzyme β- galactosidase để phân giải thành màu xanh. Tôi chọn dòng 7, 8, 9 để tiến hành bước sàng lọc tiếp theo.
Kết quả chọn lọc các dòng mang vector pTZ-ech bằng lập bản đồ giới hạn
Cơ sở: Ở 2 đầu của gene ech có chứa vị trắ nhận biết của enzyme
HindIII và SacI, nếu gene ech đã được gắn vào vector tách dòng thì khi cắt đồng thời 2 enzyme này sẽ tạo ra 2 đoạn tương ứng với gene ech khoảng 860 bp và vector pTZ57R/T mở vòng có kắch thước gần 2,9 kb (2886 bp).
A B
Hình 3.6: (A) Thiết kế in silico vector pTZ-ech; (B) Kết quả cắt kiểm tra vector tái tổ hợp đồng thời bằng SacI và EcoRI
Đường chạy M: Thang ADN chuẩn 1 kb; Đường chạy 1,2,3: Sản phẩm cắt của dòng pTZ-ech 7,8,9 tương ứng; Đường chạy 4: plasmid pTZ-ech dòng 7; Đường chạy 5:
Sản phẩm PCR khuếch đại gene ech
Sản phẩm cắt của 3 dòng đều cho 2 băng: băng phắa trên có kắch thước gần 3 kb, còn băng phắa dưới khoảng 860 bp và có vị trắ tương đương với sản phẩm PCR khuếch đại gene ech. Từ kết quả trên tôi kết luận rằng có thể đã gắn được gene ech dự kiến vào vector tách dòng pTZ57R/T.
Kết quả giải trình tự gene ech
Mục đắch giải trình tự gene ech là để xác định trình tự và so sánh gene ech được tách dòng từ chủng P. fluorescensVTCC-B-668 được phân lập tại Việt Nam so với trình tự các gene ech đã được công bố trên ngân hàng gene đồng thời kiểm tra đoạn gene ech được tách dòng có có khả năng biểu hiện hay không.
Dòng 7 và 8 được chọn để giải trình tự gene ech tại công ty MACROGENE (Hàn Quốc) sử dụng trình tự mồi xuôi, mồi ngược M13pUC trên vector pTZ57R/T để giải trình tự từ hai đầu gene. Kết quả giải trình tự gene ech ở plasmid pTZ-ech dòng 7 được trình bày ở hình 3.7.
M 1 2 3 4 5
AGAATTCAGGAGGGCATCGCCATGAGCAACTACGAAGGCCGTTGGACCACAGTCAA GGTTGAGATCGAAGAAGGCATCGCCTGGGTCATTCTCAATCGTCCGGAAAAACGCA ACGCCATGAGCCCGACCCTGAACCGGGAAATGATCGACGTCCTGGGAACCCTCGAG CAGGATCCTGCCGCCGGCGTGCTGGTCCTCACCGGTGCGGGCGAAGCCTGGACGGC GGGCATGGACCTCAAGGAATACTTTCGCGAAGTGGATGCCGGCCCGGAAATCCTCC AGGAGAAAATCCGCCGCGAAGCCTCGCAATGGCAATGGAAACTGCTGCGCATGTAC GCCAAGCCGACCATCGCCATGGTCAATGGCTGGTGCTTCGGCGGTGGCTTCAGCCC GCTGGTGGCGTGCGACCTGGCGATCTGCGCCGACGAAGCGACCTTCGGCCTTTCGG AAATCAACTGGGGCATCCCGCCGGGTAACCTGGTGAGCAAGGCCATGGCCGACACC GTGGGCCATCGTCAATCGCTGTACTACATCATGACCGGCAAGACCTTTGGCGGGCA GAAAGCCGCCGAAATGGGCCTTGTCAACGAAAGCGTGCCGCTGGCGCAACTGCGCG AAGTGACCATCGAACTGGCGCGTAACCTGCTCGAGAAAACCCCGGTGGTGCTGCGT GCCGCCAAGCATGGCTTCAAGCGCTGCCGCGAACTGACCTGGGAGCAGAACGAGGA TTACCTCTACGCCAAGCTCGATCAGTCGCGTCTGCTCGACACCGAAGGCGGTCGCG AGCAGGGCATGAAACAGTTCCTCGACGACAAGAGCATCAAGCCTGGCCTGCAGGCG
TATAAACGCTGAGAGCTCGC
(A) >EMBOSS_001_1 MSNYEGRWTTVKVEIEEGIAWVILNRPEKRNAMSPTLNREMIDVLGTLEQ DPAAGVLVLT GAGEAWTAGMDLKEYFREVDAGPEILQEKIRREASQWQWKLLRMYAKPTI AMVNGWCFGG GFSPLVACDLAICADEATFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQSLYY IMTGKTFGGQ KAAEMGLVNESVPLAQLREVTIELARNLLEKTPVVLRAAKHGFKRCRELT WEQNEDYLYA KLDQSRLLDTEGGREQGMKQFLDDKSIKPGLQAYKR* (B) (C)
(D)
Hình 3.7: Kết quả xác định trình tự gene ech
(A) Trình tự gene ech tách dòng từ Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668. Mồi xuôi và
mồi ngược được gạch chân, bộ ba mở đầu và kết thúc được in đậm;(B) Trình tự amino acid dịch mã in silico từ gene ech; (C) So sánh trình tự gene ech tách dòng với trình tự gene công bố trên NCBI.Query: Trình tự gene ech của Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668, Sbjct: Trình tự gene ech của Pseudomonas fluorescens JCM5963 công bố trên NCBI;(D) So sánh trình tự amino acid mã hóa bởi gene ech tách dòng với trình tự của P. fluorescent BF13. Userseq1: Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668, Userseq2: Pseudomonas fluorescens BF13.
Kết quả giải trình tự gene ech ở plasmid pTZ-ech dòng 7 (hình 3.7 A) cho thấy bộ ba mở đầu ATG và bộ ba kết thúc TGA được bảo toàn, kắch thước đoạn gene (từ vị trắ bộ ba mở đầu và kết thúc) là 831 bp bằng với kắch thước gene ech dùng để thiết kế mồi, vị trắ cắt của enzyme giới hạn 2 đầu gene được giữ nguyên và không đột biến. Như vậy các vị trắ quan trọng thiết kế trong mồi đều được bảo toàn đây là cơ sở đảm bảo cho công việc tiếp theo có thể thành công và gene ech có thể biểu hiện trong vi khuẩn E. coli.
Kết quả dịch mã gene in silico (hình 3.7 B) không xuất hiện stop codon vô nghĩa nào, đảm bảo sự biểu hiện hoàn toàn của gene ech tạo ra enzyme tương ứng trong vi khuẩn E. coli.
Kết quả so sánh trình tự gene ech với trình tự đã công bố trên ngân hàng gene NCBI (hình 3.7 C) cho thấy, gene ech trong pTZ-ech dòng 7 có độ
tương đồng 99% với gene ech của P. fluorescens JCM5963 đã được công bố trên Genebank mã số DQ119298. Tiếp tục so sánh, gene ech trong pTZ-ech
dòng 7 có độ tương đồng 92% với gene ech của Pseudomonas fluorescens
BF13đã được công bố trên Genebank mã sốAJ536325, đây chắnh là gene ech
dựa vào để thiết kế mồi và giữa 2 gene này có sự tương đồng 98.2% về trình tự chuỗi amino acid (hình 3.7 D).
Từ những dữ liệu trên, có thể kết luận gene ech thu được từ một chủng
Pseudomonas fluorescens được phân lập tại Việt Nam có tắnh đa hình so với các trình tự của các chủng P. fluorescent quốc tế đã công bố. Gene ech này có thể được sử dụng cho mục đắch biểu hiện gene trong E. coli.