* Kiểm tra chiều gắn của gene trên vector biểu hiện
Các gene được gắn theo thứ tự gltA→ech→fcs tương ứng với thứ tự của các vị trí cắt giới hạn duy nhất trên vector pET22b(+). Trong đó, gene
gltA được gắn trong tổ hợp HindIII→SacI, gene ech được gắn trong tổ hợp SacI→EcoRI, gene fcs được gắn trong tổ hợp EcoRI-BamHI. Nếu gene gltA
bị gắn ngược chiều tức tổ hợp enzyme giới hạn ở 2 đầu của gene gltA là SacI→HindIII, nằm ngược lại so với thiết kế ban đầu trên vector
(HindIII→SacI), như thế sẽ làm mất đi vị trí SacI để thực hiện gắn gene ech
tiếp theo. Điều này cũng xảy ra tương tự đối khi gắn gene fcs nếu gene ech bị gắn ngược chiều. Do vậy để đảm bảo hiệu quả gắn nối, tôi tiến hành kiểm tra chiều gắn của từng gene trên vector.
pTZ-gene Vector biểu hiện
Cắt đồng thời 2 enzyme giới hạn ở 2 đầu gene và tinh sạch
Gene Vector mở vòng
Gắn nối
Sản phẩm gắn nối
Biến nạp, cấy trải trên đĩa thạch Các dòng khuẩn lạc trắng
Các dòng plasmid
Vector tái tổ hợp mong muốn
Điện di sàng lọc kích thước Lập bản đồ giới hạn Ni, tách chiết plasmid
2.4.2. Nhân gene đích bằng PCR
Các vi khuẩn cho gene gồm E. coli DH5α, P. fluorescens VTCC-B-668 và Amycolatopsis sp. HR104 được nuôi phục hồi trong môi trường LB lỏng,
lắc ở 370C nuôi qua đêm, dịch nuôi cấy được ly tâm thu cặn tế bào và tách chiết ADN tổng số bằng phương pháp CTAB.
Phản ứng nhân gene đặc hiệu tiến hành với thể tích 25 µl, thành phần phản ứng PCR được trình bày dưới bảng 2.6.
Bảng 2.6: Thành phần phản ứng PCR Hóa chất Thể tích PCR Mastermix 2X 12,5 ul ADN khuôn 2 ul Mồi ( F+R) 3 ul H2O 7,5 ul
Trộn đều các thành phần sau đó đặt vào máy PCR, chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene ech, fcs được trình bày dưới hình sau: