Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Quy trình tách dịng gene và thiết kế vector biểu hiện
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tách dịng các gene gltA, ech, fcs từ E.coli DH5 , P. fluorescens VTCC-B-668 và Amycolatopsis sp.HR104 Tách chiết ADN, PCR Gene gltA, ech, fcs Vector tách dòng pTZ57R/T Gắn nối Sản phẩm gắn nối Các dịng plasmid
Ni và tách chiết plasmid Biến nạp, cấy trải trên đĩa thạch Cặn tế bào E. coli;
P. fluorescensVTCC-B-668; Amycolatopsis sp. HR104
Các dịng khuẩn lạc trắng
Điện di sàng lọc kích thước Lập bản đồ giới hạn
pTZ-gltA/ech/fcs
Giải trình tự gene
Hình 2.5: Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu hiện chứa các gene
* Kiểm tra chiều gắn của gene trên vector biểu hiện
Các gene được gắn theo thứ tự gltA→ech→fcs tương ứng với thứ tự của các vị trí cắt giới hạn duy nhất trên vector pET22b(+). Trong đó, gene
gltA được gắn trong tổ hợp HindIII→SacI, gene ech được gắn trong tổ hợp SacI→EcoRI, gene fcs được gắn trong tổ hợp EcoRI-BamHI. Nếu gene gltA
bị gắn ngược chiều tức tổ hợp enzyme giới hạn ở 2 đầu của gene gltA là SacI→HindIII, nằm ngược lại so với thiết kế ban đầu trên vector
(HindIII→SacI), như thế sẽ làm mất đi vị trí SacI để thực hiện gắn gene ech
tiếp theo. Điều này cũng xảy ra tương tự đối khi gắn gene fcs nếu gene ech bị gắn ngược chiều. Do vậy để đảm bảo hiệu quả gắn nối, tôi tiến hành kiểm tra chiều gắn của từng gene trên vector.
pTZ-gene Vector biểu hiện
Cắt đồng thời 2 enzyme giới hạn ở 2 đầu gene và tinh sạch
Gene Vector mở vòng
Gắn nối
Sản phẩm gắn nối
Biến nạp, cấy trải trên đĩa thạch Các dòng khuẩn lạc trắng
Các dòng plasmid
Vector tái tổ hợp mong muốn
Điện di sàng lọc kích thước Lập bản đồ giới hạn Nuôi, tách chiết plasmid