4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.2.2. Chuyển gene ech từ pTZ-ech sang pET22-G tạo vector tái tổ hợp
pET22-GE
Kết quả sàng lọc các dòng plasmid pET22-GE bằng điện di plasmid sàng lọc kắch thước
Sau khi biến nạp sản phẩm gắn nối giữa ech và pET22-G tôi thu được 6 dòng khuẩn lạc. Tách chiết plasmid của 6 dòng này, điện di sàng lọc các dòng có khả năng mang tổ hợp pET22-GE, bằng cách so sánh kắch thước với đối chứng pET22-G. Kết quả được thể hiện dưới hình 3.15.
Hình 3.15: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-GE
Trong các dòng plasmid trên có 5 dòng: dòng 2, 3, 4, 5, 6 có vị trắ băng cao hơn băng đối chứng là vector pET22-G. Đây có thể là các dòng đã được gắn gene ech vào pET22-G. Plasmid dòng 1 có vị trắ băng thấp hơn các plasmid dòng còn lại, đây có thể là do bị nhiễm plasmid lạ trong quá trình thao tác.
Kết quả chọn lọc các dòng plasmid pET22-GE bằng lập bản đồ giới hạn.
Hình 3.16: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng SacI và EcoRI
Đường chạy M: Thang ADN chuẩn 1 kb Đường chạy 1: Sản phẩm cắt vector pET22-G
Đường chạy 2,3,4,5,6: Sản phẩm cắt các dòng 2,3,4,5,6 tương ứng
Cơ sở: Trên vector pET22-GE có duy nhất 2 vị trắ của enzyme EcoRI và SacI nằm ở 2 đầu của gene ech, nên khi cắt đồng thời 2 enzyme này, sẽ tạo ra hai đoạn tương ứng với gene ech (khoảng 860 bp) và đoạn vector pET22 còn lại (khoảng 6,8kb).
Kết quả điện di cho thấy, cắt dòng 2,3,4,5,6 đều cho tạo ra 2 đoạn theo đúng lý thuyết. Trên pET22-GltA, do không gắn gene ech, khoảng cách giữa
SacI và EcoRI là 9bp nên khi cắt đồng thời 2 enzyme sẽ tạo ra một đoạn có kắch thước khoảng 7,6 kb, và một đoạn 9 bp do quá nhỏ nên bị chạy ra khỏi bản gel trong quá trình điện di.
Dựa vào kết quả trên, tôi kết luận đã gắn được gene ech dự kiến vào pET22-G, tạo tổ hợp pET22-GE.
Kết quả kiểm tra chiều gắn gene ech trên pET22-GE
Cơ sở: Trên pET22-GE, sau vị trắ EcoRI của gene ech có một vị trắ của enzyme BamHI. Khi cắt đồng thời bằng hai enzyme là EcoRI và BamHI, có 2 trường hợp xảy ra:
Hình 3.17: Minh họa cơ sở kiểm tra chiều gắn gene ech trong pET22-GE
- Trường hợp 1: gene ech gắn xuôi chiều. Khi đó, vị trắ EcoRI nằm gần với vị trắ BamHI của pET22b+ (cách nhau khoảng 12 nucleotide) nên khi cắt pET22-GE đồng thời bằng 2 enzyme này sẽ tạo ra 2 đoạn gene: Một đoạn kắch thước 12 nucleotide, đoạn này kắch thước quá nhỏ nên sẽ bị chạy ra khỏi bản gel trong quá trình điện di và một đoạn kắch thước khoảng 7,6 kb (7634 bp). Đây là kết quả mong đợi.
- Trường hợp 2: gene ech gắn ngược chiều. Khi đó, khoảng cách từ vị trắ EcoRI và BamHI bằng tổng kắch thước gene ech cộng thêm 10 nucleotide, tức là khi cắt đồng thời 2 enzyme đó sẽ tạo ra 2 đoạn: Một đoạn kắch thước khoảng 871 bp (tương ứng với gene ech) và một đoạn có kắch thước khoảng 6,8 kb (tương ứng với đoạn vector còn lại).
B- Gắn ngược chiều A- Gắn cùng chiều
Hình 3.18: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng EcoRI và BamHI
Đường chạy 1: plasmid dòng 2 (pET22-GE2)
Đường chạy 2,3,4,5,6: Sản phẩm cắt EcoRI-BamHI dòng 2,3,4,5,6
Khi cắt các dòng bằng EcoRI và BamHI đều cho 1 băng duy nhất, trong khi plasmid có 3 băng, chứng tỏ enzyme cắt hoàn toàn, kết quả này đúng với trường hợp 1. Như vậy gene ech được gắn cùng chiều trong vector tái tổ hợp pET22-GE,đảm bảo vị trắ enzyme EcoRI cho thắ nghiệm gắn gene fcs.