4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1.1. Tách dòng và giải trình tự gene gltA từ E.coli DH5α
Đoạn gene gltA được khuếch đại bằng cặp mồi gltA-F và gltA-R từ hệ gene vi khuẩn E. coli DH5α, kết quả PCR thể hiện ở Hình 3.1A. Sản phẩm PCR tương ứng với nhiệt độ gắn mồi tốt nhất ở 530C sẽ được tinh sạch bằng phương pháp thôi gel (Hình 3.1B), sau đó gắn nối vào vector tách dòng pTZ57R/T và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli. Cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin. Lựa chọn các khuẩn lạc trắng để nuôi tăng sinh và tách chiết ADN plasmid (Hình 3.1C).
Hình 3.1: Sản phẩm PCR gene gltA (A), sản phẩm PCR sau khi tinh sạch (B) và ADN plasmid các dòng khuẩn lạc màu trắng
(A) LD: Thang ADN chuẩn 1 kb; ĐC: đối chứng; đường chạy đánh số 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59: sản phẩm PCR khuếch đại gene gltA tương ứng với nhiệt độ gắn mồi là 530C, 540C, 550C, 560C, 570C, 580C và 590C. (B) Sản phẩm PCR sau tinh sạch. (C): Đường chạy 1: Plasmid của khuẩn lạc màu xanh (đối chứng); đường chạy 2 -> 9: plasmid của các khuẩn lạc màu trắng
Kết quả ở Hình 3.1A cho thấy, ở tất cả các nhiệt độ gắn mồi đều cho một băng rõ nét có kắch thước tương ứng với kắch thước dự đoán của gene gltA là 1284 bp. Tuy nhiên, ở nhiệt độ gắn mồi là 530C, băng ADN sáng rõ nhất (đường chạy 53). Tiếp tục thực hiện phản ứng PCR với nhiệt độ gắn mồi là 530C với thể tắch lớn hơn để tiến hành tinh sạch sản phẩm, phục vụ thắ nghiệm gắn nối vào vector tách dòng. Hình 3.1B cho thấy sản phẩm PCR chỉ còn một băng sáng rõ có kắch thước của gene gltA.
Ở hình 3.1C, plasmid ở đường chạy 2 => 9 là của các dòng khuẩn lạc trắng, có kắch thước tương đồng nhau và cao hơn kắch thước plasmid của dòng khuẩn lạc màu xanh (đường chạy 1). Trong sàng lọc khuẩn lạc trên môi trường LB/Amp/ IPTG/Xgal, khuẩn lạc trắng là dòng chứa vector đã gắn đoạn chèn còn khuẩn lạc xanh là dòng có chứa vector pTZ57R/T tự đóng vòng. Do được gắn thêm đoạn chèn nên những dòng chứa pTZ-E sẽ có vị trắ băng plasmid cao hơn so với plasmid từ khuẩn lạc xanh. Do vậy tất cả các plasmid của khuẩn lạc màu trắng đã mang đoạn xen.
Lựa chọn plasmid dòng 1, 2, (tương ứng với đường chạy 2, 3) để kiểm tra sự có mặt của gene gltA trong vector tách dòng bằng cắt enzyme giới hạn NcoI. Lý do sử dụng enzyme này là vì trên vector tách dòng pTZ57R/T không có vị trắ cắt của enzyme này và trên gene gltA có duy nhất 1 vị trắ cắt. Do vậy nếu chèn đúng gene gltA vào vector tách dòng thì khi xử lý enzyme này vector tái tổ hợp sẽ bị cắt tạo thành 1 băng có kắch thước 4170 bp (kắch thước 2886 bp của vector pTZ57R/T l + kắch thước 1284 bp của gene gltA) (Hình 3.2).
Hình 3.2: Plasmid tái tổ hợp có khả năng mang gene gltA được cắt bằng enzyme NcoI
ĐC1: plasmid của dòng 1 không cắt enzyme, đường chạy số 1: plasmid của dòng 1 cắt bằngNcoI; đường chạy 2: plasmid của dòng 2 cắt bằngNcoI; ĐC2 : plasmid của
dòng 2 không cắt enzyme.
Kết quả hình 3.2 cho thấy plasmid dòng 1 và 2 sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn đều cho 1 băng với kắch thước xấp xỉ 4170 bp theo tắnh toán lý thuyết (đường chạy 1 và 2). Do vậy dòng 1 và 2 đều có gene gltA gắn vào vector tách dòng pTZ57R/T. Dòng 1 được lựa chọn để xác định trình tự nucleotide. Kết quả xác định trình tự gene gltA được thể hiện trong Hình 3.3 (A).
CGATGCATCTAGATTTGAGCTCAGAAGGAGATATACATATGGCTGATACAAA AGCAAAACTCACCCTCAACGGGGATACAGCTGTTGAACTGGATGTGCTGAAA GGCACGCTGGGTCAAGATGTTATTGATATCCGTACTCTCGGTTCAAAAGGTG TGTTCACCTTTGACCCAGGCTTCACTTCAACCGCATCCTGCGAATCTAAAAT TACTTTTATTGATGGTGATGAAGGTATTTTGCTGCACCGCGGTTTCCCGATC GATCAGCTGGCGACCGATTCTAACTACCTGGAAGTTTGTTACATCCTGCTGA ATGGTGAAAAACCGACTCAGGAACAGTATGACGAATTTAAAACTACGGTGAC CCGTCATACCATGATCCACGAGCAGATTACCCGTCTGTTCCATGCTTTCCGT CGCGACTCGCATCCAATGGCAGTCATGTGTGGTATTACCGGCGCGCTGGCGG CGTTCTATCACGACTCGCTGGATGTTAACAATCCTCGTCACCGTGAAATTGC CGCGTTCCGCCTGCTGTCGAAAATGCCGACCATGGCCGCGATGTGTTACAAG TATTCCATTGGTCAGCCATTTGTTTACCCGCGCAACGATCTCTCCTACGCCG GTAACTTCCTGAATATGATGTTCTCCACGCCGTGCGAACCGTATGAAGTTAA TCCGATTCTGGAACGTGCTATGGACCGTATTCTGATCCTGCACGCTGACCAT
GAACAGAACGCCTCTACCTCCACCGTGCGTACCGCTGGCTCTTCGGGTGCGA ACCCGTTTGCCTGTATCGCAGCAGGTATTGCTTCACTGTGGGGACCTGCGCA CGGCGGTGCTAACGAAGCGGCGCTGAAAATGCTGGAAGAAATCAGCTCCGTT AAACACATTCCGGAATTTGTTCGTCGTGCGAAAGACAAAAATGATTCTTTCC GCCTGATGGGCTTCGGTCACCGCGTGTACAAAAATTACGACCCGCGCGCCAC CGTAATGCGTGAAACCTGCCATGAAGTGCTGAAAGAGCTGGGCACGAAGGAT GACCTGCTGGAAGTGGCTATGGAGCTGGAAAACATCGCGCTGAACGACCCGT ACTTTATCGAGAAGAAACTGTACCCGAACGTCGATTTCTACTCTGGTATCAT CCTGAAAGCGATGGGTATTCCGTCTTCCATGTTCACCGTCATTTTCGCAATG GCACGTACCGTTGGCTGGATCGCCCACTGGAGCGAAATGCACAGTGACGGTA TGAAGATTGCCCGTCCGCGTCAGCTGTATACAGGATATGAAAAACGCGACTT TAAAAGCGATATCAAGCGTTAAAAGCTTTAATCGGATCCCGGGCCCGTCGAC TGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTTCCCTATAGTGAGTCGTATATTTCGTTTC GCTATAGTTCGCAATTTTCGAAA (A) >EMBOSS_001_1 MADTKAKLTLNGDTAVELDVLKGTLGQDVIDIRTLGSKGVFTFDPGFTST ASCESKITFI DGDEGILLHRGFPIDQLATDSNYLEVCYILLNGEKPTQEQYDEFKTTVTR HTMIHEQITR LFHAFRRDSHPMAVMCGITGALAAFYHDSLDVNNPRHREIAAFRLLSKMP TMAAMCYKYS IGQPFVYPRNDLSYAGNFLNMMFSTPCEPYEVNPILERAMDRILILHADH EQNASTSTVR TAGSSGANPFACIAAGIASLWGPAHGGANEAALKMLEEISSVKHIPEFVR RAKDKNDSFR LMGFGHRVYKNYDPRATVMRETCHEVLKELGTKDDLLEVAMELENIALND PYFIEKKLYP NVDFYSGIILKAMGIPSSMFTVIFAMARTVGWIAHWSEMHSDGMKIARPR QLYTGYEKRD FKSDIKR* (B)
Hình 3.3: Kết quả xác định trình tự gene gltA
(A)Trình tự gene gltA tách dòng từ E. coli DH5α; (B) Trình tự amino acid dịch
Gene gltA tách dòng từ vi khuẩn E. coli DH5α có kắch thước 1284 bp có mã mở đầu ATG và mồi xuôi gltA-F (gạch chân) ở đầu 5Ỗ và có bộ ba mã kết thúc TAA và trình tự mồi ngược gltA-R (gạch chân) ở đầu 3Ỗ. Vị trắ cắt của enzyme giới hạn ở 2 đầu của gene được bảo toàn. Kết quả phân tắch NCBI BLAST cho thấy trình tự gene gltA tách dòng có độ tương đồng 100% với trình tự gene gltA của E. coli sp. K-12 MC4100 mã số HG7388671. Trình tự gene gltA được dịch mã in silico bằng công cụ trực tuyến EMBOSS Transeq cho thấy gene được dịch mã thành công, đảm bảo cho sự biểu hiện của gene này trong E. coli.