Bảng 2.2: Các thành phần của vector pRSET – A
Thành phần Vai trị Vị trí
Vùng khởi đầu sao chép pUC ori
Cho phép tạo ra số lượng bản sao plasmid lớn trong E
.coli
Base 2047 – 2720
Gene kháng Ampicilin Chọn lọc các dòng mang vector tái tổ hợp
Base 1042 – 1902 T7 promoter Kiểm soát chặt chẽ sự biểu
hiện của gene
Base 20 – 39 Vị trí đa tách dịng (MCS) Cho phép gắn gene quan tâm Base 202 – 248
XpressTM Epitope Base 169 – 192
Tín hiệu kết thúc của T7 Cho phép kết thúc quá trình phiên mã
Base 256 – 385
Vị trí của mồi ngược cho T7 promoter
Đảm bảo trật tự các đoạn chèn
Base 295 – 314
F1 ori Cho phép tổng hợp sợi ADN Base 456 – 911
Vector biểu hiện pET22b(+)
Đây là một vector biểu hiện có các yếu tố cần thiết cho sự biểu hiện các gene gltA, ech, fcs.
Các thành phần cấu tạo trong vector pRT22b(+) được thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 2.3: Các thành phần của vector pET22b (+)
Thành phần Vị trí
T7 promoter 361-377
T7 transcription start 360
pelB coding sequence 224-289
Multiple cloning sites (NcoI – XhoI) 158-225
His•Tag coding sequence 140-157
T7 terminator 26-72
lacI coding sequence 764-1843
pBR322 origin 3277
bla coding sequence 4038-4895
f1 origin 5027-5482
Vector pET22b(+) được thiết kế có vùng đa tách dịng (hình 3.3) với 15 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn: AvaI, XhoI, NotI, EagI, HindIII, SacI, EcoRI, BamHI, NcoI, MscI, BseRI, BspMI, NdeI, XbaI, cho phép gắn các gene quan tâm
vào vector và biểu hiện ra sản phẩm mong muốn. Tất cả đều cho một vị trí cắt duy nhất trên vector, đảm bảo việc gắn gene một các đặc hiệu và gene được gắn không bị mất đi ở những bước cắt, gắn nối tiếp theo. Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, tôi quy định chiều từ BamHI đến HindIII là chiều 5’→3’.
Vector pET22b(+) mang trình tự C-terminal His*tag, thuận lợi cho việc tinh sạch protein, vị trí khởi đầu sao chép tạo ra số bản sao thấp (low copy) trong tế bào E. coli.
Promoter T7 cho phép tế bào kiểm soát chặc chẽ sự biểu hiện của gene thông qua hệ thống gene điều hịa, có khả năng biểu hiện cao khi cảm ứng IPTG.
Gene kháng ampicillin giúp cho vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp có thể sinh trưởng bình thường trên mơi trường có chứa kháng sinh, giúp chọn lọc những dịng có mang plasmid mong muốn.
Lý do tôi sử dụng vector pET22b(+) là do pET22b(+) có chứa thêm một trình tự chuỗi tín hiệu N-terminal pelB quy định tiết protein
vào khoang chu chất (hay gian bào), điều này có nhiều ưu điểm đó là giảm sự phân cắt protein đích, protein khơng gây độc cho tế bào, hầu hết protein khi được tiết ra khoang chu chất đều là protein tan, có chức năng sinh học. Khoang chu chất của tế bào E. coli chứa các enzyme xúc tác
việc tạo thành hoặc tái sắp xếp cầu disulfide, vì vậy các protein tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli thường được định hướng vận chuyển đến đây.
2.1.3. Mồi khuếch đại các gene gltA, fcs và ech.
Để khuếch đại các gene gltA, ech, fcs từ E. coli, P. fluorescensVTCC-B-668 và Amycolatopsissp. HR104 (DSM 9991),
chúng tôi sử dụng các cặp mồi được thiết kế dựa vào trình tự gene các gene đã cơng bố trên NCBI. Trình tự các cặp mồi được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 2.4: Trình tự mồi khuếch đại gene
Tên
mồi Trình tự mồi (chiều 5’→3’)
Kích thước gene (bp) gltA-F 5'TGAGCTCAGAAGGATATACATATGGCTGATACAAAA3' 1284 gltA-R 5'AAAGCTTTTAACGCTTGATATCGCTTT3' Ech-F 5'AGAATTCAGGAGGGCATCGCCATGAGCAACTACGA3' 831 Ech-R 5'GCGAGCTCTCAGCGTTTATACGCCTGCAG3' Fcs-F 5'TAATGCGCAACCAGGGTCTG3' 1476 Fcs-R 5'ACCGTCACAGAGTAGCCGCA3'
Trình tự mồi được thiết kế vị trí cắt enzyme giới hạn mỗi đầu tương ứng với mỗi gene để thuận lợi cho quá trình cắt, nối ADN. Ở mồi xuôi bao gồm vị trí bám của ribosome, khoảng trống, bộ ba mở đầu, trình tự bắt cặp. Ở mồi ngược bao gồm bộ ba kết thúc và trình tự bắt cặp.
2.1.4. Hóa chất
- Gắn nối gene vào vector
o Enzym nối T4 ADN ligase và buffer T4 ADN ligase được cung cấp từ hãng Thermo Scientific
- Tách chiết ADN plasmid
o Solution I: Tris HCl 1M pH8, EDTA 0.5M pH8, glucose, H2O khử ion
o Solution II: NaOH 3M, SDS 10%
o Solution III: CH3COOK 3M, CH3COOH, H2O khử ion - Điện di
o Agarose
o Dung dịch đệm TAE(Tris base, EDTA, NAOH, Acid acetic)
o Đệm tra mẫu ( Loading dye6X)
o Ethidium bromide - Cắt enzyme giới hạn
o Các loại enzyme giới hạn: BamHI, SacI, EcoRI, HindIII , NcoI…và
buffer tương ứng - Thôi gel
o Các hóa chất đi kèm bộ Kit tách chiết ADN từ gel: MEGA- spinTM Agarose Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific
- Môi trường nuôi E. coli
o LB lỏng: Bacto trypton, dịch chiết nấm men, NaCl, nước khử trùng
o LB đặc: Bacto trypton, dịch chiết nấm men, NaCl, nước khử trùng, agar - Chuẩn bị tế bào khả biến
o CaCl2
o Glycerol
- Biến nạp, chọn lọc khuẩn lạc, cảm ứng sinh tổng hợp vanillin
o Kháng sinh ampicilin o Xgal o IPTG - PCR o Buffer o MgCl220mM o Taq-ADN Polymerase o dNTPs o Nước khử ion - HPLC
o Dung môi A: ACN/methanol (v/v = 1: 1)
o Dung môi B: nước khử ion/acetic acid (v/v = 99.8: 0.2, pH 2.88)
o Chất chuẩn: Vanillin, Axit ferulic
- Tinh chiết vanillin từ dịch nổi nuôi E. coli
o Dichloromethane
o NaCl - Dụng cụ
Pipet, eppendorf, đầu tip, ống fancol, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, giấy bạc...
2.1.5. Thiết bị
Bảng 2.5: Danh mục các thiết bị
STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ
1 Bộ điện di Scie – plas Ltd – UK
2 Máy chụp gel Gel Logic 1500 – Kodak – USD
3 Máy cất nước Canada Bio Water system – Pall Co.UK 4 Tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu – 425 – 400E – Nuaire – USA 5 Máy đo pH F – 51 BW – Horiba – Japan 6 Nồi hấp khử trùng HV – 110 – Hirayama – Japan 7 Cân điện tử TE 214S – Startorius Germany 8 Máy li tâm Eppendorf – CHLB Đức
9 Tủ lạnh -200C; -800C Super freezer Eco 130 – Ficchetti – Italy 10 Máy votex Vortex Geneius 3 – IKA Genemany/ China 11 Máy spindown E- centrifuge – Wealtex – Taiwan/USA 12 Bể ổn nhiệt Techne – OSI
13 Máy lắc S3000 – Jeotech – Korea
14 Máy PCR Amplied Biosystems USA/ Singapore 15 HPLC Máy HPLC 1260 Agilent
Cột RP C18 Zorbax (250 mm x 4.6 mm id, 5 µm, Agilent, USA).
16 Lên men Labfors – Infors HT
Và một số thiết bị phịng thí nghiệm cơ bản khác
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên.
2.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Tách dòng gene
Ba genes gltA mã hoá citrate synthase, fcs mã hóa feruloyl-CoA
synthase, và ech mã hóa enoyl-CoA hydratase/aldolase được tách dòng lần
lượt từ Escherichia coli, Amycolatopsis và Pseudomonas fluorescent. Các
dịng được giải trình tự và phân tích trình tự đảm bảo biểu hiện được protein mã hóa. Các chủng vi sinh vật được đặt mua từ Ngân hàng Vi sinh vật Đức (Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) và Ngân hàng Vi sinh vật của Đại học Quốc gia Hà Nội.
Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện mang các genes gltA, ech và fcs
Các gene sau khi được tách dịng và xác định trình tự được chuyển sang vector biểu hiện dưới dạng thiết kế 1 polycistronic operon để đảm bảo biểu hiện đồng thời cả 2 gene đích. Đề tài sử dụng các hệ vector khác nhau nhằm tìm ra hệ thống có năng lực sản xuất vanillin mạnh nhất.
Nội dung 3: Đưa vector vào tế bào chủ, cảm ứng biểu hiện các gene đích
Vector biểu hiện sau khi được kiểm tra bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn sẽ được đưa vào chủng E. coli BL21(DE3) để sản xuất ba enzyme
mã hóa con đường chuyển hóa vanillin.
Nội dung 4: Phân tích vanillin sản phẩm tạo thành
Vanillin sản phẩm tạo thành từ axit ferulic dưới sự xúc tác của các enzyme feruloyl-CoA synthase và enoyl-CoA hydratase/aldolase do E. coli
tái tổ hợp tạo ra sẽ được phân tích định tính và định lượng bằng phương pháp Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mẫu chuẩn sử dụng trong HPLC là vanillin tinh khiết 99% cung cấp bởi hãng Sigma-Aldrich.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Quy trình tách dịng gene và thiết kế vector biểu hiện
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tách dịng các gene gltA, ech, fcs từ E.coli DH5 , P. fluorescens VTCC-B-668 và Amycolatopsis sp.HR104 Tách chiết ADN, PCR Gene gltA, ech, fcs Vector tách dòng pTZ57R/T Gắn nối Sản phẩm gắn nối Các dịng plasmid
Ni và tách chiết plasmid Biến nạp, cấy trải trên đĩa thạch Cặn tế bào E. coli;
P. fluorescensVTCC-B-668; Amycolatopsis sp. HR104
Các dịng khuẩn lạc trắng
Điện di sàng lọc kích thước Lập bản đồ giới hạn
pTZ-gltA/ech/fcs
Giải trình tự gene