4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.3.3. Sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ sinh học
1.3.3.1. Sử dụng enzyme
Những hiểu biết về con đường sinh tổng hợp vanillin và các enzyme tham gia tạo cơ sở cho việc thiết lập một hệ thống enzyme in vitro để sản xuất vanillin.
Dignum và cộng sự đã mô tả việc sử dụng chế phẩm enzyme chứa ư- glucosidase xúc tác phản ứng thủy phân vanillin từ glucovanillin để thu được vanillin giải phóng từ vỏ quả vanilla như một sự thay thế quá trình ủ truyền thống, rút ngắn thời gian [20].
Ngoài enzyme trên còn có một số enzyme khác được sử dụng để tạo ra vanillin từ các nguyên liệu thực vật khác bằng các biến đổi sinh học. Năm 1989, Kamoda và cộng sự đã sử dụng enzyme lignostilbene αβ-dioxygenease được thu nhận từ Pseudomonas sp. TMY1009 xúc tác sự oxi hóa giải phóng vanillin từ Xtinben tìm thấy phổ biến trong vỏ gỗ [36].
Các enzyme được tạo ra bởi tách dòng gene mã hóa enzyme lipoxygenease từ đậu týõng đã đýợc biểu hiện trong một số vi sinh vật biến đổi gene để thãm dò khả năng tổng hợp vanillin từ este của coniferyl alcohol [48].
Vanillin còn được giải phóng từ creosol (một thành phần chắnh của creosote được thu từ xử lắ nhiệt gỗ hoặc than đá) và vanillylamine (được thu bởi quá trình thủy phân capsaicin là phần cay chủ yếu của hồ tiêu). Năm 2001, Van den Huevel và cộng sự sử dụng enzyme vanillyl alcohol oxidase (VAO), một flavoenzyme đặc trưng của Penicillium biến đổi cả creosol và vanillylamine thành vanillin với hiệu suất cao. Sự chuyển đổi trung gian VAO của creosol trải qua một quá trình gồm hai bước trong đó ban đầu là sự hình thành vanillyl alcohol sau đó bị oxi hóa thành vanillin. Tuy nhiên creosol không thể được xem như một cơ chất tự nhiên bởi vì có sự biến đổi hóa học mạnh của gỗ hoặc than đá [77].
1.3.3.2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
Có một số nghiên cứu khám phá ra khả năng trao đổi chất ở thực vật để sản xuất chất thơm trong đó có vanillin trong nuôi cấy mô tế bào như lá và cuống lá cuả Vanilla planifolia. Chiến lược nuôi cấy mô tế bào bao gồm dinh dưỡng của cơ chất, sử dụng hoormon ức chế các con đường cạnh tranh, cố định tế bào, điều chỉnh điều kiện môi trường và sử dụng chất hấp phụ như than hoạt tắnh, nhựa để thu hồi vanillin được tạo ra [79].
Năm 1991, Knuth và Sahai đã phát hiện rằng bản chất và nồng độ của các cơ chất được thêm vào môi trường là một yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy V.fragrans. Phenyladenine và axit ferulic cho kết quả ắt tăng cường tạo vanillin, trong khi đó thêm vanillyl alcohol lại cho kết quả tăng hàm lượng vanillin [40].
Năm 1993, Westcott và cộng sự đã cải tiến một quy trình sản xuất vanillin tự nhiên từ các rễ khắ sinh sử dụng axit ferulic như một chất xúc tác sinh học. Than hoạt tắnh cũng được sử dụng đóng vai trò như một chất hấp phụ vanillin tạo ra, do vậy có thể giảm thiểu được sự ức chế quá trình xảy ra. Các mô rễ khắ sinh có thể được dùng lại một vài lần nhưng hoạt tắnh sẽ giảm qua mỗi lần sử dụng. Nồng độ của vanillin tạo ra cao hơn khoảng 35 lần so với lượng vanillin ban đầu có trong mô rễ khắ sinh và chiếm khoảng 40% vanillin có trong quả vanilla trưởng thành. Sử dụng rễ khắ sinh bổ sung axit ferulic, vanillin tạo ra nhanh hơn tổng hợp bình thường trong quả từ 5 đến 10 lần. Mặc dù đã có nghiên cứu mô tả thành công sự tắch lũy vanillin từ nuôi cấy mô tế bào, song năng suất thực tế không đủ để sản xuất thương mại [80].
Ngoài ra, trong quá trình nuôi cấy mô tế bào còn gặp phải một số vấn đề như tắnh không ổn định của tế bào, tỉ lệ sinh trưởng thấp, đòi hỏi điều kiện vô trùng. Do vậy, đó không phải là lý tưởng cho sản xuất vanillin thương mại. Hơn thế nữa, ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong tạo Vanilla còn là một vấn đề mơ hồ bởi vì còn thiếu những hiểu biết về con đường sinh tổng hợp vanillin và các enzyme tham gia [79].
1.3.3.3. Lên men vi sinh vật
Vi sinh vật với khả năng sinh trưởng nhanh chóng và tuân theo di truyền học phân tử là những mục tiêu lý tưởng cho công nghệ sinh học và có thể được tuyển chọn cho sản xuất vanillin bởi khả năng sinh trưởng trên các cơ chất như một nguồn cacbon và năng lượng.
Trên thế giới đã có các nghiên cứu về quá trình lên men vi sinh vật sản xuất vanillin từ các cơ chất khác nhau, dưới đây là bảng tóm tắt một số kết quả của các tác giả.
Bảng 1.4: Các chủng vi sinh vật với khả năng sản xuất vanillin trên các cơ chất
Cơ chất Vi sinh vật Năng
suất(g/L) Nguồn tham khảo
Eugeneol
Pseudomonas sp. TK2102 0.28 (Washisu et al.1993)
Pseudomonas sp.HR199 0.44 (Overhage et al., 1999) [51]
Pseudomonas resinovorans SPR1 0.24 (M. Ashengroph, Nahvi, Zarkesh-Esfahani, & Momenbeik, 2011b) [9] Isoeugene ol Pseudomonas aeruginosa 1.62 (M. Ashengroph, Nahvi, Zarkesh-Esfahani, & Momenbeik, 2011c) [10]
Bacillus subtilis B2 0.9 (Shimoni, Ravid, & Shoham, 2000) [70]
Bacillus subtilis HS8 8.1 (Y. Zhang, Xu, Han, Yan, & Ma, 2006) [90]
Pseudomonas putida IE27 16.1 (Yamada, Okada, Yoshida, & Nagasawa, 2007) [82]
Candida galli PG06 0.58 (M. Ashengroph, Nahvi, Zarkesh- Esfahani, & Momenbeik, 2011a) [8]
Psychrobacter sp. CSW4 1.28
(Morahem Ashengroph, Nahvi, Zarkesh-Esfahani, & Momenbeik, 2012) [11]
Axit ferulic
Amycolatopsis .sp
(DSM9991 or DSM9992) 11.5 (Rabenhorst & Hopp, 1997) [64]
Streptomyces setonii ATCC
39116 13.9
(Muheim, MỵLLER, Mủnch, & Wetli, 2012) [52]
Pseudomonas fluorescens
AN103 **
(Martắnez-Cuesta, Payne, Hanniffy, Gasson, & Narbad, 2005) [49]
Pseudomonas fluorescens
BF13
** (Calisti et al.2008) [18]
Mặc dù các vi sinh vật trên có khả năng tạo ra vanillin từ các cơ chất khác nhau song chúng có nhược điểm là đều có con đường phân hủy vanillin thành các sản phẩm phụ như acid vanillic, vanillyl alcohol,...Đối với một số xạ khuẩn do sinh trưởng của hệ sợi nấm làm môi trường trở lên nhớt, khó kiểm soát sự vỡ ra từng mảnh và phân giải của sợi nấm nên gây khó khăn cho quá trình lên men.
Do vậy, yêu cầu đặt ra là phải tìm được vật chủ thắch hợp để tạo chủng tái tổ hợp biểu hiện các gene tổng hợp vanillin từ các cơ chất có sẵn, có quá tŕnh lên men đơn giản, không có con đường phân hủy vanillin.