4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1.3. Tách dòng và giải trình tự gene fcs từ từ Amycolatopsissp HR104
Kết quả tách chiết ADN tổng số từ Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991)
Hình 3.8: Kết quả tách ADN tổng số từ Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991)
Đường chạy từ 1-4 : tương ứng với bốn ống cặn xạ khuẩn
Trong 4 mẫu được tách chiết, ADN tổng số của mẫu số 1 và 2 bị nhiễm tạp chất nhiều, trong khi đó mẫu số 3 và 4 cho băng gọn, sáng, không đứt gãy, do đó được lựa chọn để thực hiện phản ứng khuếch đại gene fcs
Kết quả khuếch đại và tách dòng gene fcs
Cặp mồi fcs-F và fcs-R được sử dụng để khuếch đại gene fcs từ tế bào vi khuẩn Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991), kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose (Hình 3.8 A). Vector tách dòng pTZ57R/T cũng được sử dụng để gắn đoạn gene fcs và biến nạp vào tế bào E.coli, sau đó cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung ampicilin. Lựa chọn các dòng khuẩn lạc trắng để nuôi tăng sinh và tách chiết ADN plasmid, kết quả ở hình 3.8 B. Dòng plasmid có mang vector tái tổ hợp chứa gene fcs được cắt enzyme giới hạn EcoRI và BamHI để xác định việc gắn thành công gene fcs vào vector tách dòng pTZ57R/T (Hình 3.8 C).
A B C
Hình 3.9: Sản phẩm PCR gene fcs (A), plasmid các dòng có khả năng mang gene fcs (B), cắt plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và BamHI (C).
(A): L: Thang ADN chuẩn 1 kb; đường chạy 1: sản phẩm khuếch đại gene fcs (B): X: Khuẩn lạc xanh, Đường chạy từ 1->9: Các dòng khuẩn lạc trắng
(C): L: thang ADN chuẩn 1 kb; 1: plasmid dòng 1 không cắt; 2: plasmid dòng 1 cắt bằng EcoRI và BamHI; 3: plasmid khuẩn lạc xanh cắt bằng EcoRI và BamHI; 4: plasmid khuẩn lạc xanh không cắt
Hình 3.9A cho thấy, ở đường chạy số 1 có một băng duy nhất tương ứng với kắch thước sản phẩm PCR kắch thước 1580bp của gene fcs. Vậy có thể đã khuếch đại thành công gene fcs từ vi khuẩn Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991). Có thể thấy ở hình 3.9B chỉ có plasmid ở đường chạy số 1 là có kắch thước cao hơn kắch thước của khuẩn lạc xanh ở đường chạy X, đây có thể là dòng mang vector pTZ-fcs nên được lựa chọn cho sàng lọc tiếp theo. Kết quả cắt
enzyme giới hạn EcoRI và BamHI ở hình 4.9C cho thấy ở plasmid dòng 1 khi cắt bằng 2 enzyme này cho 2 băng (đường chạy 2): một băng có kắch thước sản phẩm PCR của gene fcs (1580bp) và một băng có kắch thước 2847bp của vector pTZ57R/T, điều đó chứng tỏ plasmid dòng 1 là vector pTZ57R/T đã gắn được gene fcs.
Kết quả giải trình tự gene fcs
Dòng 1 được tiếp tục xác định trình tự nucleotide, kết quả ở hình 3.10.
TAATGCGCAACCAGGGTCTGGGCTCCTGGCCGGTGCGCCGCGCCAGGATGAG CCCGCACGCGACAGCCGTCCGGCACGGCGGGACGGCGCTGACCTACGCCGAG CTGTCCCGCCGCGTCGCGCGGCTCGCCAACGGGCTGCGGGCCGCCGGGGTCC GCCCCGGCGACCGGGTGGCCTACCTCGGGCCGAACCACCCGGCCTACCTGGA GACCCTGTTCGCGTGCGGGCAGGCCGGCGCGGTGTTCGTGCCGCTGAACTTC CGGCTGGGCGTCCCGGAACTGGACCACGCGCTGGCCGACTCCGGCGCGTCGG TCCTTATCCACACCCCGGAGCACGCGGAGACGGTCGCGGCGCTCGCCGCCGG CCGGCTGCTGCGCGTGCCCGCGGGCGAGCTGGACGCCGCGGACGACGAGCCG CCCGACCTGCCCGTCGGCCTCGACGACGTGTGCCTGCTGATGTACACCTCGG GCAGCACCGGACGCCCCAAGGGCGCGATGCTCACCCACGGCAACCTCACCTG GAACTGCGTCAACGTCCTGGTGGAGACCGACCTGGCGAGCGACGAGCGGGCA CTGGTCGCCGCGCCGCTGTTCCACGCCGCCGCGCTCGGCATGGTGTGCCTGC CCACCCTGCTCAAGGGCGGCACGGTGATCCTGCACTCCGCGTTCGACCCCGG CGCCGTGCTGTCCGCGGTGGAACAGGAGCGGGTCACGCTCGTGTTCGGCGTG CCCACGATGTACCAGGCGATCGCCGCGCACCCGCGGTGGCGCAGCGCCGACC TGTCCAGCCTGCGGACCCTGCTGTGCGGCGGCGCGCCGGTGCCCGCCGACCT CGCCAGCCGCTACCTCGACCGCGGGCTCGCGTTCGTGCAGGGCTACGGCATG ACCGAGGCCGCGCCGGGCGTGCTGGTCCTCGACCGCGCGCACGTCGCGGAGA AGATCGGCTCCGCCGGGGTGCCCTCGTTCTTCACCGACGTGCGGCTGGCCGG CCCGTCCGGCGAGCCGGTGCCGCCGGGGGAGAAGGGCGAGATCGTGGTCAGC GGGCCCAACGTGATGAAGGGCTACTGGGGCAGGCCGGAGGCGACCGCCGAGG TGCTGCGCGACGGGTGGTTCCACTCCGGCGACGTGGCCACCGTGGGCGGCGA CGGGTACTTCCACGTCGTCGACCGGCTCAAGGACATGATCATCTCCGGCGGC GAGAACATCTACCCGGCCGAGGTGGAGAACGAGCTGTACGGCTACCCGGGTG
TGGAGGCGTGCGCCGTGATCGGCGTGCCGGACCCGCGCTGGGGCGAGGTGGG CAAGGCGGTCGTCGTGCCCGCCGACGGGAGCCGCATCGACGGCGACGAGCTG CTGGCCTGGCTGCGCACCCGGCTGGCCGGGTACAAGGTGCCCAAGTCGGTCG AGTTCACCGACCGGCTGCCCACGACCGGCTCCGGCAAGATCCTCAAGGGCGA GGTCCGCCGCCGCTTCGGCTGACCAGGGGCCGATGAACCCCGCTCATGCGGC CCTGCCGGCCCGCTGCGGCTACTCTGTGACGGT (A) >EMBOSS_001_1 MRNQGLGSWPVRRARMSPHATAVRHGGTALTYAELSRRVARLANGLRAAGVRPGDRVAYL GPNHPAYLETLFACGQAGAVFVPLNFRLGVPELDHALADSGASVLIHTPEHAETVAALAA GRLLRVPAGELDAADDEPPDLPVGLDDVCLLMYTSGSTGRPKGAMLTHGNLTWNCVNVLV ETDLASDERALVAAPLFHAAALGMVCLPTLLKGGTVILHSAFDPGAVLSAVEQERVTLVF GVPTMYQAIAAHPRWRSADLSSLRTLLCGGAPVPADLASRYLDRGLAFVQGYGMTEAAPG VLVLDRAHVAEKIGSAGVPSFFTDVRLAGPSGEPVPPGEKGEIVVSGPNVMKGYWGRPEA TAEVLRDGWFHSGDVATVGGDGYFHVVDRLKDMIISGGENEIYPAEVENELYGYPGVEACA VIGVPDPRWGEVGKAVVVPADGSRIDGDELLAWLRTRLAGYKVPKSVEFTDRLPTTGSGK ILKGEVRRRFG* (B)
(C)
(D)
Hình 3.10: Kết quả xác định và phân tắch trình tự gene fcs
(A) Trình tự gene fcs tách dòng từ Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991). Mồi xuôi và mồi ngược được gạch chân, bộ ba mở đầu và kết thúc được in đậm; (B) Trình tự amino acid dịch mã in silico từ gene fcs; (C) So sánh trình tự gene fcs tách dòng với trình tự gene công bố trên NCBI. Query: Trình tự gene fcs của Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991), Sbjct: Trình tự gene fcs của Amycolatopsis sp. HR167 công bố trên NCBI; (D) So sánh
trình tự amino acid mã hóa bởi gene fcs tách dòng với trình tự fcs của các sinh vật khác. Query: Amycolatopsis sp. HR104, Sbjct: các trình tự tương đồng 99%.
Kết quả giải trình tự gene fcs cho thấy gene có độ dài 1476 bp có bộ ba mã mở đầu (ATG) và mã kết thúc (TGA) được bảo toàn (hình 3.10A). Dịch mã in silico gene fcs tách dòng không xuất hiện mã kết thúc giữa gene (hình 4.10B). Gene fcs tách dòng từ Amycolatopsissp. HR104 tương đồng 99% với chủng Amycolatopsis sp. HR167 trên Genebank (mã số AJ290449.1) được dùng trong thiết kế mồi (hình 3.10C). So sánh trình tự amino acid cho thấy mức độ tương đồng 99% của gene tách dòng với gene fcs của các sinh vật khác bao gồm Amycolatopsis sp. HR167 (mã số NCBI CAC18323.1);
E. coli (mã số NCBI AHZ90668.1); Pediococcus acidilactici (mã số NCBI AIT38259.1); (hình 7D) và Streptomyces sp. V-1 (mã số NCBI AGR34008.1).
Như vậy có thể kết luận đã tách dòng thành công gene fcs có thể sử dụng để thiết kế vector biểu hiện.
3.2. Thiết kế vector biểu hiện chứa 3 gene gltA, ech, fcs trên nền tảng vector pET22b+