Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.10. Xác định trình tự nucleotide
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc của phương pháp dideoxy cải tiến của Sanger căn cứ vào sự kéo dài chuỗi ADN mới theo nguyên tắc bổ sung bởi ADN polymerase khi có mặt của các ddNTP và mồi. Phản ứng kéo dài được làm ngừng bằng cách bổ sung dideoxyribonucleosid triphosphate (ddNTP). Mỗi ddNTP sử dụng có thể được gắn với một phân tử huỳnh quang và mỗi nucleotide cho một màu riêng biệt. Cho tất cả bốn loại ddNTP đã đánh dấu vào cùng một ống, sau đó các đoạn ADN có màu được phân tách theo kích thước bằng điện di trên cùng một ống điện di mao quản. Các đoạn ADN khác nhau sẽ phân tách trên gel mao quản và xuất hiện dưới dạng các đỉnh với
màu đi kèm. Các đỉnh được phát hiện bằng cách sử dụng nguồn laser. Đọc trình tự ADN bằng cách xác định màu của đỉnh khi chúng đi qua thiết bị phát hiệnvà thông tin này sẽ được chuyển trực tiếp đến một máy tính và sẽ xác định được trình tự ADN.
Các dịng plasmid được giải trình tự ở cơng ty MACROGENE (Hàn Quốc). Các gene được giải trình tự ởhai đầu sử dụng trình tự mồi xi và mồi ngược M13/pUC trên vector tách dòng pTZ57R/T.
Sử dụng chức năng Align của phần mềm vector NTI để so sánh, tìm ra điểm sai khác giữa 2 trình tự để có xử lí lỗi đồng thời tìm ra trình tự chung giữa 2 trình tự gene được tổng hợp từ 2 mồi để nối ghép thành trình tự gene hồn chỉnh
2.4.11. Phân tích trình tự gene đã tách dịng
Các gene đích gltA, ech và fcs sau khi giải trình tự được so sánh với trình tự gene gltA, ech, fcs đã được công bố trên ngân hàng gene NCBI thông qua chương trình BLAST.(http://www.ncbi.nil.gov).
Trình tự các gene tách dòng được dịch mã in silico bằng phần mềm
Vector NTI v11.5 hoặc công cụ trực tuyến Translate Tool tại địa chỉ http://web.expasy.org/translate/
2.4.12. Nuôi E. coli sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic
Phương pháp nuôi E. coli tái tổ hợp mang vector pET-GEF hoặc
pRSET-GEF để sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic được tiến hành theo Yoon và cộng sự [84]. Khuẩn lạc trên đĩa thạch được nhặt sang nuôi trong 5 ml LB lỏng có bổ sung ampicilin 37oC lắc 200 v/p qua đêm. Sáng hôm sau, 5 ml dịch nuôi được chuyển sang 200 ml LB lỏng bổ sung ampicilin trong bình tam giác 1 lít và ni lắc 200 v/p trong khoảng 3-4 tiếng. Khi OD 260 nm đạt 0.4, sinh tổng hợp vanillin được cảm ứng bằng IPTG nồng độ 0.5 mM (1 ml dung dịch IPTG 100 mM được bổ sung vào 200 ml dịch nuôi). Đồng thời, cơ chất axit ferulic được bổ sung vào để đạt nồng độ 3 g/L (0,6 ml dung dịch axit
ferulic nồng độ 100 g/L pH 7.0 được bổ sung vào 200 ml dịch nuôi). Tiếp tục nuôi đến các mốc thời gian 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h, 42h và 48h. Dịch nuôi được thu tại một số mốc thời gian tùy theo yêu cầu thí nghiệm, đo OD hoặc/và ly tâm 10000 v/p loại bỏ cặn tế bào. Dịch nổi được dùng cho phân tích HPLC.
2.4.13. Lên men sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit ferulic
Lên men E. coli sinh tổng hợp vanillin bổ sung cơ chất axit ferulic
được thực hiện theo hai phương pháp.
Phương pháp thứ nhất: Sử dụng bình tam giác theo Yoon và cộng sự.
Tương tự như mục 3.4.12 tuy nhiên thay đổi thể tích ni thành 1 lít ni trong bình tam giác 2 lít.
Phương pháp thứ hai: Sử dụng hệ thống lên men Labfors, quy trình
theo Phùng Thu Nguyệt và CS (2009) với một số cải tiến [4].
Chủng lên men: Chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang vector pET-
GEF và pRSET-GEF. Chủng được chuẩn bị bằng cách nuôi trong bình tam giác chứa 50 ml mơi trường LB ở 37oC qua đêm, lắc 200 v/p.
Cơ chất axit ferulic: Axit ferulic được hịa tan trong mơi trường LB và
chỉnh pH về 7.0 bằng NaOH 2N.
Thiết bị lên men: Sử dụng hệ thống lên men Labfors dung tích 2 lít của
hãng Infors HT. Hệ thống lên men được điều khiển bằng phần mềm Iris V5.3.
Môi trường lên men: Môi trường lên men LB được bổ sung kháng sinh
Ampicilin 100 µg/mL. Chất phá bọt polypropylene glycol (PPG) được bổ sung với tỉ lệ 1/10000.
Điều kiện lên men: Các điều kiện lên men được thiết lập pH 7,0; nhiệt
độ 370C; khí được sục 1 lít/phút; tốc độ khuấy 200 vịng/phút. Giống lên men chuẩn bị qua đêm được cấy vào bình lên men theo tỉ lệ 1/1000. Một số thơng số chính của q trình lên men gồm pH, nhiệt độ, tốc độ khuấy… được điều khiển tự động bằng phần mềm Iris V5.3.
Cảm ứng sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic: Khi OD260 đạt mức 0,4
trong bình lên men, cơ chất axit ferulic và chất cảm ứng IPTG được bổ sung vào dịch lên men ở các nồng độ lần lượt là 3 g/L và 0,5 mM.
Thu dịch nổi chứa vanillin: Sau khi cảm ứng ở các mức thời gian xác
định, quá trình lên men được ngừng lại. Tế bào E. coli được loại bỏ bằng ly
tâm. Dịch nổi chứa vanillin được thu nhận.
2.4.14.Phân tích vanillin và axit ferulic bằng HPLC
Cơ chất axit ferulic còn lại và vanillin tạo thành trong dịch nổi nuôi cấy tế bào E. coli được xác định định tính và định lượng bằng phương pháp HPLC đảo pha theo quy trình của Sinha và cộng sự có cải tiến. Hệ thống phân tích HPLC 1260 Agilent được trang bị cột RP C18 Zorbax (250 mm x 4.6 mm id, 5 µm, Agilent, USA). Dung mơi A bao gồm ACN/methanol (v/v = 1: 1) và dung môi B bao gồm nước khử ion/acetic acid (v/v = 99.8: 0.2, pH 2.88). Bước sóng phát hiện 280 nm. Nhiệt độ duy trì trong buồng lưu giữ cột là 25 độ C, thể tích tiêm mẫu là 20 µL. Tốc độ dịng: 1 mL/phút. Chương trình chạy 23 phút được thiết lập như trong 2.9.
Bảng 2.9: Chương trình chạy HPLC phân tích axit ferulic và vanillin Thời gian (phút) Dung môi A (%) Dung môi B (%)
0.01 5 95
5 25 75
15 50 50
20 75 25
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách dịng và giải trình tự các gene mã hóa các enzyme xúc tác con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic
3.1.1. Tách dịng và giải trình tự gene gltA từ E. coli DH5α
Đoạn gene gltA được khuếch đại bằng cặp mồi gltA-F và gltA-R từ
hệ gene vi khuẩn E. coli DH5α, kết quả PCR thể hiện ở Hình 3.1A. Sản phẩm PCR tương ứng với nhiệt độ gắn mồi tốt nhất ở 530C sẽ được tinh sạch bằng phương pháp thơi gel (Hình 3.1B), sau đó gắn nối vào vector tách dòng pTZ57R/T và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli. Cấy trải trên mơi trường LB đặc có bổ sung ampicillin. Lựa chọn các khuẩn lạc trắng để nuôi tăng sinh và tách chiết ADN plasmid (Hình 3.1C).
Hình 3.1: Sản phẩm PCR gene gltA (A), sản phẩm PCR sau khi tinh sạch (B) và ADN plasmid các dòng khuẩn lạc màu trắng
(A) LD: Thang ADN chuẩn 1 kb; ĐC: đối chứng; đường chạy đánh số 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59: sản phẩm PCR khuếch đại gene gltA tương ứng với nhiệt độ gắn mồi là 530C, 540C, 550C, 560C, 570C, 580C và 590C. (B) Sản phẩm PCR sau tinh sạch. (C): Đường chạy 1: Plasmid của khuẩn lạc màu xanh (đối chứng); đường chạy 2 -> 9: plasmid của các khuẩn lạc màu trắng
Kết quả ở Hình 3.1A cho thấy, ở tất cả các nhiệt độ gắn mồi đều cho một băng rõ nét có kích thước tương ứng với kích thước dự đốn của gene gltA là 1284 bp. Tuy nhiên, ở nhiệt độ gắn mồi là 530C, băng ADN sáng rõ nhất (đường chạy 53). Tiếp tục thực hiện phản ứng PCR với nhiệt độ gắn mồi là 530C với thể tích lớn hơn để tiến hành tinh sạch sản phẩm, phục vụ thí nghiệm gắn nối vào vector tách dịng. Hình 3.1B cho thấy sản phẩm PCR chỉ cịn một băng sáng rõ có kích thước của gene gltA.
Ở hình 3.1C, plasmid ở đường chạy 2 => 9 là của các dịng khuẩn lạc trắng, có kích thước tương đồng nhau và cao hơn kích thước plasmid của dòng khuẩn lạc màu xanh (đường chạy 1). Trong sàng lọc khuẩn lạc trên môi trường LB/Amp/ IPTG/Xgal, khuẩn lạc trắng là dòng chứa vector đã gắn đoạn chèn cịn khuẩn lạc xanh là dịng có chứa vector pTZ57R/T tự đóng vịng. Do được gắn thêm đoạn chèn nên những dịng chứa pTZ-E sẽ có vị trí băng plasmid cao hơn so với plasmid từ khuẩn lạc xanh. Do vậy tất cả các plasmid của khuẩn lạc màu trắng đã mang đoạn xen.
Lựa chọn plasmid dòng 1, 2, (tương ứng với đường chạy 2, 3) để kiểm tra sự có mặt của gene gltA trong vector tách dòng bằng cắt enzyme giới hạn NcoI. Lý do sử dụng enzyme này là vì trên vector tách dịng pTZ57R/T khơng có vị trí cắt của enzyme này và trên gene gltA có duy nhất 1 vị trí cắt. Do vậy nếu chèn đúng gene gltA vào vector tách dịng thì khi xử lý enzyme này vector tái tổ hợp sẽ bị cắt tạo thành 1 băng có kích thước 4170 bp (kích thước 2886 bp của vector pTZ57R/T l + kích thước 1284 bp của gene gltA) (Hình 3.2).
Hình 3.2: Plasmid tái tổ hợp có khả năng mang gene gltA được cắt bằng enzyme NcoI
ĐC1: plasmid của dịng 1 khơng cắt enzyme, đường chạy số 1: plasmid của dòng 1 cắt bằngNcoI; đường chạy 2: plasmid của dòng 2 cắt bằngNcoI; ĐC2 : plasmid của
dịng 2 khơng cắt enzyme.
Kết quả hình 3.2 cho thấy plasmid dịng 1 và 2 sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn đều cho 1 băng với kích thước xấp xỉ 4170 bp theo tính tốn lý thuyết (đường chạy 1 và 2). Do vậy dịng 1 và 2 đều có gene gltA gắn vào vector tách dòng pTZ57R/T. Dòng 1 được lựa chọn để xác định trình tự nucleotide. Kết quả xác định trình tự gene gltA được thể hiện trong Hình 3.3 (A).
CGATGCATCTAGATTTGAGCTCAGAAGGAGATATACATATGGCTGATACAAA AGCAAAACTCACCCTCAACGGGGATACAGCTGTTGAACTGGATGTGCTGAAA GGCACGCTGGGTCAAGATGTTATTGATATCCGTACTCTCGGTTCAAAAGGTG TGTTCACCTTTGACCCAGGCTTCACTTCAACCGCATCCTGCGAATCTAAAAT TACTTTTATTGATGGTGATGAAGGTATTTTGCTGCACCGCGGTTTCCCGATC GATCAGCTGGCGACCGATTCTAACTACCTGGAAGTTTGTTACATCCTGCTGA ATGGTGAAAAACCGACTCAGGAACAGTATGACGAATTTAAAACTACGGTGAC CCGTCATACCATGATCCACGAGCAGATTACCCGTCTGTTCCATGCTTTCCGT CGCGACTCGCATCCAATGGCAGTCATGTGTGGTATTACCGGCGCGCTGGCGG CGTTCTATCACGACTCGCTGGATGTTAACAATCCTCGTCACCGTGAAATTGC CGCGTTCCGCCTGCTGTCGAAAATGCCGACCATGGCCGCGATGTGTTACAAG TATTCCATTGGTCAGCCATTTGTTTACCCGCGCAACGATCTCTCCTACGCCG GTAACTTCCTGAATATGATGTTCTCCACGCCGTGCGAACCGTATGAAGTTAA TCCGATTCTGGAACGTGCTATGGACCGTATTCTGATCCTGCACGCTGACCAT
GAACAGAACGCCTCTACCTCCACCGTGCGTACCGCTGGCTCTTCGGGTGCGA ACCCGTTTGCCTGTATCGCAGCAGGTATTGCTTCACTGTGGGGACCTGCGCA CGGCGGTGCTAACGAAGCGGCGCTGAAAATGCTGGAAGAAATCAGCTCCGTT AAACACATTCCGGAATTTGTTCGTCGTGCGAAAGACAAAAATGATTCTTTCC GCCTGATGGGCTTCGGTCACCGCGTGTACAAAAATTACGACCCGCGCGCCAC CGTAATGCGTGAAACCTGCCATGAAGTGCTGAAAGAGCTGGGCACGAAGGAT GACCTGCTGGAAGTGGCTATGGAGCTGGAAAACATCGCGCTGAACGACCCGT ACTTTATCGAGAAGAAACTGTACCCGAACGTCGATTTCTACTCTGGTATCAT CCTGAAAGCGATGGGTATTCCGTCTTCCATGTTCACCGTCATTTTCGCAATG GCACGTACCGTTGGCTGGATCGCCCACTGGAGCGAAATGCACAGTGACGGTA TGAAGATTGCCCGTCCGCGTCAGCTGTATACAGGATATGAAAAACGCGACTT TAAAAGCGATATCAAGCGTTAAAAGCTTTAATCGGATCCCGGGCCCGTCGAC TGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTTCCCTATAGTGAGTCGTATATTTCGTTTC GCTATAGTTCGCAATTTTCGAAA (A) >EMBOSS_001_1 MADTKAKLTLNGDTAVELDVLKGTLGQDVIDIRTLGSKGVFTFDPGFTST ASCESKITFI DGDEGILLHRGFPIDQLATDSNYLEVCYILLNGEKPTQEQYDEFKTTVTR HTMIHEQITR LFHAFRRDSHPMAVMCGITGALAAFYHDSLDVNNPRHREIAAFRLLSKMP TMAAMCYKYS IGQPFVYPRNDLSYAGNFLNMMFSTPCEPYEVNPILERAMDRILILHADH EQNASTSTVR TAGSSGANPFACIAAGIASLWGPAHGGANEAALKMLEEISSVKHIPEFVR RAKDKNDSFR LMGFGHRVYKNYDPRATVMRETCHEVLKELGTKDDLLEVAMELENIALND PYFIEKKLYP NVDFYSGIILKAMGIPSSMFTVIFAMARTVGWIAHWSEMHSDGMKIARPR QLYTGYEKRD FKSDIKR* (B)
Hình 3.3: Kết quả xác định trình tự gene gltA
(A)Trình tự gene gltA tách dịng từ E. coli DH5α; (B) Trình tự amino acid dịch
Gene gltA tách dòng từ vi khuẩn E. coli DH5α có kích thước 1284 bp có mã mở đầu ATG và mồi xuôi gltA-F (gạch chân) ở đầu 5’ và có bộ ba mã kết thúc TAA và trình tự mồi ngược gltA-R (gạch chân) ở đầu 3’. Vị trí cắt của
enzyme giới hạn ở 2 đầu của gene được bảo tồn. Kết quả phân tích NCBI BLAST cho thấy trình tự gene gltA tách dịng có độ tương đồng 100% với
trình tự gene gltA của E. coli sp. K-12 MC4100 mã số HG7388671. Trình tự
gene gltA được dịch mã in silico bằng công cụ trực tuyến EMBOSS Transeq cho thấy gene được dịch mã thành công, đảm bảo cho sự biểu hiện của gene này trong E. coli.
3.1.2. Tách dịng và giải trình tự gene ech từ Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 VTCC-B-668
Kết quả khuếch đại gene ech từ cặn tế bào Pseudomonas fluorescens
bằng phương pháp PCR
Hình 3.4: Kết quả PCR khuếch đại gene ech
Đường chạy 1: Sản phẩm PCR; Đường chạy M: Thang ADN chuẩn 1 kb
Sản phẩm PCR gene ech có kích thước dự kiến là 860 bp. Sản phẩm
PCR thu được 1 băng sáng rõ duy nhất nằm trong khoảng kích thước, đây có thể là gene ech theo lý thuyết.
Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech bằng điện di so sánh kích thước
1 kb 750 bp ≈860 bp
Sau khi gắn gene ech vào vector pTZ57R/T và biến nạp sản phẩm gắn nối vào E. coli DH5α, kết quả thu được 15 dòng khuẩn lạc trắng và 6 khuẩn lạc xanh. Chọn ngẫu nhiên 9 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh nuôi trong môi trường LB lỏng thu sinh khối, tách chiết plasmid và kết quả điện di như sau:
Hình 3.5: Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech
Đường chạy 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Plasmid các dòng khuẩn lạc trắng Đường chạy 10: Plasmid dòng khuẩn lạc xanh
Plasmid các dòng sau khi điện di đều cho 2 băng tương ứng với hai cấu hình dạng siêu xoắn ở dýới và dạng vòng ở trên. Plasmid các dòng 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 cho vị trí băng cao hơn so với dòng khuẩn lạc xanh, đây có thể là những dòng mang pTZ-ech.
Dòng 3, 5 có vị trí băng plasmid tương đương với dịng khuẩn lạc xanh, đây có thể cũng là vector tự đóng vịng, nhưng lại cho khuẩn lạc màu trắng, điều này có thể là do trải Xgal không đều trên đĩa thạch nên ở vị trí đó khơng có cơ chất để vector tự đóng vịng biểu hiện enzyme β- galactosidase để phân giải thành màu xanh. Tơi chọn dịng 7, 8, 9 để tiến hành bước sàng lọc tiếp theo.
Kết quả chọn lọc các dòng mang vector pTZ-ech bằng lập bản đồ giới hạn
Cơ sở: Ở 2 đầu của gene ech có chứa vị trí nhận biết của enzyme
HindIII và SacI, nếu gene ech đã được gắn vào vector tách dịng thì khi cắt
đồng thời 2 enzyme này sẽ tạo ra 2 đoạn tương ứng với gene ech khoảng 860
bp và vector pTZ57R/T mở vịng có kích thước gần 2,9 kb (2886 bp). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A B
Hình 3.6: (A) Thiết kế in silico vector pTZ-ech; (B) Kết quả cắt kiểm tra vector tái tổ hợp đồng thời bằng SacI và EcoRI
Đường chạy M: Thang ADN chuẩn 1 kb; Đường chạy 1,2,3: Sản phẩm cắt của dòng pTZ-ech 7,8,9 tương ứng; Đường chạy 4: plasmid pTZ-ech dòng 7; Đường chạy 5:
Sản phẩm PCR khuếch đại gene ech
Sản phẩm cắt của 3 dịng đều cho 2 băng: băng phía trên có kích thước gần 3 kb, cịn băng phía dưới khoảng 860 bp và có vị trí tương đương với sản phẩm PCR khuếch đại gene ech. Từ kết quả trên tơi kết luận rằng có thể đã
gắn được gene ech dự kiến vào vector tách dòng pTZ57R/T.
Kết quả giải trình tự gene ech
Mục đích giải trình tự gene ech là để xác định trình tự và so sánh
gene ech được tách dòng từ chủng P. fluorescensVTCC-B-668 được phân lập tại Việt Nam so với trình tự các gene ech đã được công bố trên ngân
hàng gene đồng thời kiểm tra đoạn gene ech được tách dịng có có khả năng biểu hiện hay khơng.
Dịng 7 và 8 được chọn để giải trình tự gene ech tại công ty MACROGENE (Hàn Quốc) sử dụng trình tự mồi xi, mồi ngược M13pUC trên vector pTZ57R/T để giải trình tự từ hai đầu gene. Kết quả giải trình tự gene ech ở plasmid pTZ-ech dịng 7 được trình bày ở hình 3.7.
M 1 2 3 4 5
AGAATTCAGGAGGGCATCGCCATGAGCAACTACGAAGGCCGTTGGACCACAGTCAA GGTTGAGATCGAAGAAGGCATCGCCTGGGTCATTCTCAATCGTCCGGAAAAACGCA ACGCCATGAGCCCGACCCTGAACCGGGAAATGATCGACGTCCTGGGAACCCTCGAG CAGGATCCTGCCGCCGGCGTGCTGGTCCTCACCGGTGCGGGCGAAGCCTGGACGGC GGGCATGGACCTCAAGGAATACTTTCGCGAAGTGGATGCCGGCCCGGAAATCCTCC AGGAGAAAATCCGCCGCGAAGCCTCGCAATGGCAATGGAAACTGCTGCGCATGTAC GCCAAGCCGACCATCGCCATGGTCAATGGCTGGTGCTTCGGCGGTGGCTTCAGCCC GCTGGTGGCGTGCGACCTGGCGATCTGCGCCGACGAAGCGACCTTCGGCCTTTCGG AAATCAACTGGGGCATCCCGCCGGGTAACCTGGTGAGCAAGGCCATGGCCGACACC GTGGGCCATCGTCAATCGCTGTACTACATCATGACCGGCAAGACCTTTGGCGGGCA GAAAGCCGCCGAAATGGGCCTTGTCAACGAAAGCGTGCCGCTGGCGCAACTGCGCG AAGTGACCATCGAACTGGCGCGTAACCTGCTCGAGAAAACCCCGGTGGTGCTGCGT GCCGCCAAGCATGGCTTCAAGCGCTGCCGCGAACTGACCTGGGAGCAGAACGAGGA TTACCTCTACGCCAAGCTCGATCAGTCGCGTCTGCTCGACACCGAAGGCGGTCGCG AGCAGGGCATGAAACAGTTCCTCGACGACAAGAGCATCAAGCCTGGCCTGCAGGCG TATAAACGCTGAGAGCTCGC (A) >EMBOSS_001_1 MSNYEGRWTTVKVEIEEGIAWVILNRPEKRNAMSPTLNREMIDVLGTLEQ DPAAGVLVLT GAGEAWTAGMDLKEYFREVDAGPEILQEKIRREASQWQWKLLRMYAKPTI AMVNGWCFGG GFSPLVACDLAICADEATFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQSLYY IMTGKTFGGQ KAAEMGLVNESVPLAQLREVTIELARNLLEKTPVVLRAAKHGFKRCRELT WEQNEDYLYA KLDQSRLLDTEGGREQGMKQFLDDKSIKPGLQAYKR* (B) (C)
(D)
Hình 3.7: Kết quả xác định trình tự gene ech
(A) Trình tự gene ech tách dịng từ Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668. Mồi xuôi và
mồi ngược được gạch chân, bộ ba mở đầu và kết thúc được in đậm;(B) Trình tự amino acid dịch mã in silico từ gene ech; (C) So sánh trình tự gene ech tách dịng với trình tự gene cơng bố trên NCBI.Query: Trình tự gene ech của Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668, Sbjct: Trình tự gene ech của Pseudomonas fluorescens JCM5963 cơng bố trên NCBI;(D) So sánh trình tự amino acid mã hóa bởi gene ech tách dịng với trình tự của P. fluorescent BF13. Userseq1: Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668, Userseq2: Pseudomonas fluorescens BF13.
Kết quả giải trình tự gene ech ở plasmid pTZ-ech dịng 7 (hình 3.7 A) cho thấy bộ ba mở đầu ATG và bộ ba kết thúc TGA được bảo tồn, kích thước đoạn gene (từ vị trí bộ ba mở đầu và kết thúc) là 831 bp bằng với kích thước gene ech dùng để thiết kế mồi, vị trí cắt của enzyme giới hạn 2 đầu gene được giữ nguyên và khơng đột biến. Như vậy các vị trí quan trọng thiết kế trong mồi đều được bảo tồn đây là cơ sở đảm bảo cho cơng việc tiếp theo có thể thành cơng và gene ech có thể biểu hiện trong vi khuẩn E. coli.
Kết quả dịch mã gene in silico (hình 3.7 B) khơng xuất hiện stop codon vô nghĩa nào, đảm bảo sự biểu hiện hoàn toàn của gene ech tạo ra enzyme tương ứng trong vi khuẩn E. coli.
Kết quả so sánh trình tự gene ech với trình tự đã cơng bố trên ngân