4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4.13. Lên men sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit ferulic
Lên men E. coli sinh tổng hợp vanillin bổ sung cơ chất axit ferulic được thực hiện theo hai phương pháp.
Phương pháp thứ nhất: Sử dụng bình tam giác theo Yoon và cộng sự. Tương tự như mục 3.4.12 tuy nhiên thay đổi thể tắch nuôi thành 1 lắt nuôi trong bình tam giác 2 lắt.
Phương pháp thứ hai: Sử dụng hệ thống lên men Labfors, quy trình theo Phùng Thu Nguyệt và CS (2009) với một số cải tiến [4].
Chủng lên men: Chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang vector pET- GEF và pRSET-GEF. Chủng được chuẩn bị bằng cách nuôi trong bình tam giác chứa 50 ml môi trường LB ở 37oC qua đêm, lắc 200 v/p.
Cơ chất axit ferulic: Axit ferulic được hòa tan trong môi trường LB và chỉnh pH về 7.0 bằng NaOH 2N.
Thiết bị lên men: Sử dụng hệ thống lên men Labfors dung tắch 2 lắt của hãng Infors HT. Hệ thống lên men được điều khiển bằng phần mềm Iris V5.3.
Môi trường lên men: Môi trường lên men LB được bổ sung kháng sinh Ampicilin 100 ộg/mL. Chất phá bọt polypropylene glycol (PPG) được bổ sung với tỉ lệ 1/10000.
Điều kiện lên men: Các điều kiện lên men được thiết lập pH 7,0; nhiệt độ 370C; khắ được sục 1 lắt/phút; tốc độ khuấy 200 vòng/phút. Giống lên men chuẩn bị qua đêm được cấy vào bình lên men theo tỉ lệ 1/1000. Một số thông số chắnh của quá trình lên men gồm pH, nhiệt độ, tốc độ khuấyẦ được điều khiển tự động bằng phần mềm Iris V5.3.
Cảm ứng sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic: Khi OD260 đạt mức 0,4 trong bình lên men, cơ chất axit ferulic và chất cảm ứng IPTG được bổ sung vào dịch lên men ở các nồng độ lần lượt là 3 g/L và 0,5 mM.
Thu dịch nổi chứa vanillin: Sau khi cảm ứng ở các mức thời gian xác định, quá trình lên men được ngừng lại. Tế bào E. coli được loại bỏ bằng ly tâm. Dịch nổi chứa vanillin được thu nhận.
2.4.14.Phân tắch vanillin và axit ferulic bằng HPLC
Cơ chất axit ferulic còn lại và vanillin tạo thành trong dịch nổi nuôi cấy tế bào E. coli được xác định định tắnh và định lượng bằng phương pháp HPLC đảo pha theo quy trình của Sinha và cộng sự có cải tiến. Hệ thống phân tắch HPLC 1260 Agilent được trang bị cột RP C18 Zorbax (250 mm x 4.6 mm id, 5 ộm, Agilent, USA). Dung môi A bao gồm ACN/methanol (v/v = 1: 1) và dung môi B bao gồm nước khử ion/acetic acid (v/v = 99.8: 0.2, pH 2.88). Bước sóng phát hiện 280 nm. Nhiệt độ duy trì trong buồng lưu giữ cột là 25 độ C, thể tắch tiêm mẫu là 20 ộL. Tốc độ dòng: 1 mL/phút. Chương trình chạy 23 phút được thiết lập như trong 2.9.
Bảng 2.9: Chương trình chạy HPLC phân tắch axit ferulic và vanillin Thời gian (phút) Dung môi A (%) Dung môi B (%)
0.01 5 95
5 25 75
15 50 50
20 75 25
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN