Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên năng suất sinh tổng
3.5. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên năng suất sinh tổng hợp vanillin vanillin
Các điều kiện ni cấy có ảnh hưởng đến hiệu suất sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic. Chúng tôi thử nghiệm một số điều kiện bao gồm các loại môi trường nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng và thời gian nuôi cấy.
3.5.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Trong một số nghiên cứu trước [43], [84] các tác giả đã tìm ra thời gian ni cấy tối ưu cho sinh tổng hợp vanillin bằng E. coli tái tổ hợp là 36 tiếng. Tuy nhiên, hệ vector được sử dụng trong các nghiên cứu đó dựa trên pBAD và pBluescript khác với các hệ thống pRSET và pET của đề tài này, vì vậy chúng tơi tiến hành đánh giá lại thời gian ni cấy tối ưu.
Hình 3.24: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp vanillin của chủng E. coli tái tổ hợp.
Axit ferulic (3 g/L) và IPTG (1 mM) được bổ sung vào dịch nuôi cấy tại thời điểm 4h khi OD600nm đạt khoảng 0.4
Kết quả trên hình 3.24 cho thấy ở mốc 12h sinh trưởng tế bào đạt mức cao nhất tuy nhiên lượng vanillin tạo thành còn thấp. Từ 12h trở đi sinh trưởng tế bào giảm dần. Tại thời điểm 36h mặc dù sinh trưởng tế bào ở mức thấp nhưng hàm lượng vanillin được tạo thành và tích tụ đạt mức tối đa. Nuôi thêm lên mốc thời gian 42h hàm lượng vanillin giảm đi do mối tương quan giữa lượng vanillin được sinh tổng hợp với lượng vanillin bị phân hủy đã trở nên bất lợi trong khi sinh trưởng tế bào đã đạt mức thấp nhất. Kết quả này đồng thuận với các nghiên cứu trước [43] [84]. Điều này cho thấy yếu tố thời gian nuôi cấy không chịu sự chi phối của các hệ vector khác nhau mà do bản chất sinh học của tế bào vật chủ, ở đây là E. coli, và bản chất hóa học của vanillin.
Thời gian nuôi 36h được lựa chọn cho các bước tiếp theo.
3.5.2. So sánh các môi trường LB, M9 và 2YT
Các nghiên cứu trước đã cho thấy thành phần mơi trường có ảnh hưởng tới sinh tổng hợp vanillin. Trong nghiên cứu này chúng tôi thử nghiệm 3 loại môi trường bao gồm môi trường tiêu chuẩn LB, môi trường tối thiểu nghèo carbon M9 và môi trường giàu dinh dưỡng 2YT.
Hình 3.25: So sánh khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp vanillin của E. coli tái tổ hợp trên các mơi trường LB, M9 và 2YT.
Hình 3.25 cho thấy sinh trưởng của E. Coli thấp nhất ở môi trường tối thiểu M9 đồng thời tỉ lệ thuận với lượng vanillin tạo thành. Tuy nhiên, ở môi trường giàu dinh dưỡng 2YT, mặc dù sinh trưởng tế bào tốt hơn hai môi trường LB và M9 nhưng lượng vanillin tạo thành lại không bằng LB. Kết quả này cho thấy môi trường cân bằng dinh dưỡng LB phù hợp hơn trong việc nuôi cấy E. coli tái tổ hợp để sinh tổng hợp vanillin. Mơi trường LB do đó được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG
Ở các thí nghiệm trước chúng tơi sử dụng nồng độ IPTG 1 mM theo đề xuất của nhà cung cấp vector. Trong thí nghiệm này chúng tơi bố trí dãy nồng độ IPTG nhằm tìm ra nồng độ tối thiểu đáp ứng được nhiệm vụ cảm ứng biểu hiện các gene đích gltA, ech và fcs xúc tác sinh tổng hợp vanillin.
Kết quả trên hình 3.26 cho thấy lượng vanillin tạo thành cao nhất đạt 1.6 g/L khi được cảm ứng ở nồng độ IPTG 2 mM. Tuy nhiên, nồng độ IPTG 0.5 mM cũng tạo thành lượng vanillin lên tới 1.52 g/L, vượt trội hoàn toàn so với mức 0.7 g/L ở nồng độ IPTG 0.2 mM. Mức chênh lệch của lượng vanillin sản phẩm cảm ứng bởi nồng độ IPTG 0.5 mM và 2 mM là không thật sự lớn, trong khi lượng IPTG cần dùng chênh nhau 4 lần. Vì vậy, chúng tơi sử dụng nồng độ IPTG 0.5 mM cho các bước tiếp theo.