4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.2.1. Chuyển gene gltA từ pTZ-gltA sang pET22b+ tạo vector tái tổ hợp
pET22-G
Gene gltA (1284 bp), mã hóa cho enzyme citrate synthase, xúc tác cho phản ứng chuyển đổi acety-CoA thành CoA làm tăng hiệu quả tiêu thụ axit ferulic, được tách dòng từ vi khuẩn E. coli DH5α. Ở 2 đầu gene gltA có chứa vị trắ cắt của hai enzyme giới hạn HindIII và SacI. Gene gltA đã được tách dòng thành công từ vi khuẩn E. coli ở thắ nghiệm trước đó, được sử dụng làm vật liệu cung cấp gene gltA.
Kết quả sàng lọc các dòng plasmid pET22-G bằng điện di plasmid sàng lọc kắch thước
Sau khi biến nạp sản phẩm gắn nối giữa gene gltA và vector pET22b(+) mở vòng chúng tôi thu được 10 dòng khuẩn lạc. Kết quả tách chiết plasmid và điện di sàng lọc trên gel agarose như hình 3.11.
Hình 3.11: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-G
D1→10: Các dòng plasmid khuẩn lạc trắng
Kết quả điện di cho thấy trong 10 dòng khuẩn lạc, có dòng 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10 xuất hiện băng plasmid cóvị trắ cao hơn băng đối chứng là vector gốc pET22b(+), đây có thể là vector pET22b(+) đã được gắn gene gltA. Tôi chọn dòng 1, 7 cho bước chọn lọc tiếp theo.
Kết quả chọn lọc các dòng plasmid pET22-G bằng lập bản đồ giới hạn Chọn lọc lần hai với plasmid dòng 1,7 bằng phản ứng cắt đồng thời hai enzyme HindIII và SacI .
Hình 3.12: Cắt plasmid dòng 1,7 bằng đồng thời 2 enzyme HindIII và SacI
Đường chạy 1, 2: Sản phẩm cắt dòng 1, 7 Đường chạy M: Thang ADN chuẩn 1 kb
Sau khi cắt đã tạo ra được 2 băng: một băng kắch thước khoảng 1284 bp (tương ứng với kắch thước gene gltA) và một băng kắch thước khoảng 5,5 kb (tương ứng với kắch thước cuả vector pET22b+, còn băng mờ phắa trên có thể là do phản ứng cắt chưa hoàn toàn. Từ kết quả trên có thể coi đây là vector pET22-G theo lý thuyết.
Kiểm tra chiều gắn gene gltA trong pET22-G.
Dựa trên cơ sở trên gene gltA có 1 vị trắ nhận biết của enzyme NcoI, trên vector pET22 cũng có 1 vị trắ cắt của NcoI. Có hai trường hợp xảy ra (hình 4.13):
Hình 3.13: Minh hoạ cơ sở kiểm tra chiều gắn gene gltA trong pET22-G - Trường hợp 1: gltA gắn xuôi chiều. Trên bản đồ vector, khoảng cách giữa 2 vị trắ nhận biết của enzyme NcoI là 569 bp, nên khi cắt bằng enzyme
NcoI sẽ tạo ra hai băng có kắch thước khoảng 569 bp và 6,2 kb.
- Trường hợp 2: gltA gắn ngược chiều. Khoảng cách giữa 2 vị trắ nhận biết NcoI là 809 bp, nên khi cắt bằng enzyme NcoI sẽ tạo ra hai băng có kắch thước khoảng 809 bp và 6 kb.
Hình 3.14: Kết quả cắt pET22-G dòng 1,7 bằng enzyme NcoI
Đường chạy 1, 2: Sản phẩm cắt plasmid dòng 1 và 7 Đường chạy M: Thang ADN chuẩn 1 kb
Kết quả điện di hình 3.13 đúng với trường hợp 1. Như vậy, gene gltA
được gắn đúng chiều trong vector pET22-G, đảm bảo vị trắ enzyme SacI cho phản ứng gắn gene ech tiếp theo.