4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên.
2.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Tách dòng gene
Ba genes gltA mã hoá citrate synthase, fcs mã hóa feruloyl-CoA synthase, và ech mã hóa enoyl-CoA hydratase/aldolase được tách dòng lần lượt từ Escherichia coli, Amycolatopsis và Pseudomonas fluorescent. Các dòng được giải trình tự và phân tắch trình tự đảm bảo biểu hiện được protein mã hóa. Các chủng vi sinh vật được đặt mua từ Ngân hàng Vi sinh vật Đức (Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) và Ngân hàng Vi sinh vật của Đại học Quốc gia Hà Nội.
Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện mang các genes gltA, ech và fcs
Các gene sau khi được tách dòng và xác định trình tự được chuyển sang vector biểu hiện dưới dạng thiết kế 1 polycistronic operon để đảm bảo biểu hiện đồng thời cả 2 gene đắch. Đề tài sử dụng các hệ vector khác nhau nhằm tìm ra hệ thống có năng lực sản xuất vanillin mạnh nhất.
Nội dung 3: Đưa vector vào tế bào chủ, cảm ứng biểu hiện các gene đắch
Vector biểu hiện sau khi được kiểm tra bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn sẽ được đưa vào chủng E. coli BL21(DE3) để sản xuất ba enzyme mã hóa con đường chuyển hóa vanillin.
Nội dung 4: Phân tắch vanillin sản phẩm tạo thành
Vanillin sản phẩm tạo thành từ axit ferulic dưới sự xúc tác của các enzyme feruloyl-CoA synthase và enoyl-CoA hydratase/aldolase do E. coli tái tổ hợp tạo ra sẽ được phân tắch định tắnh và định lượng bằng phương pháp Sắc kắ lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mẫu chuẩn sử dụng trong HPLC là vanillin tinh khiết 99% cung cấp bởi hãng Sigma-Aldrich.